Мечение зондов для GP-ПЦР. 5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов

Материалы
• 5 х смесь для мечения олигонуклеотидов: на 500 мкл требуется 100 мкл раствора А, 250 мкл раствора В и 150 мкл раствора С.
Раствор А: 1,25 М трис-HCl, 1,25 М MgClj, pH 8,0 1 мл
Меркаптоэтанол 18 м кл
dТТР(100мМ) 5мкл
dGТР(ЮОмМ) 5мкл
dATP(lOOMM) 5мкл

Раствор В: 2 М HEPES, рН 6,6
Раствор С: гексануклеотиды (90 ОД на 1 мл ТЭ) До использования хранить при -20 С
• dCTP: активность 3000 Ки/ммоль (например, фирмы NEN DuPont)
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА
• Легкоплавкая агароза (фирмы BioRad)
• Сефадекс G-50
• Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I

мечение зондов пцр

Методика
1. Проводят GP-ПЦР по отдельности для клонированных в плазмидах ДНК HPV 6, 11, 16, 18, 31 и 33; каждой из ДНК берут по 1 нг.
2. Разделяют ПЦР-продукты с помощью электрофореза в 1% легкоплавком агарозном геле.
3. Безопасной бритвой вырезают из геля полоски, где сконцентрированы фрагменты ДНК длиной 140-150 п.н„ стараясь захватить как можно меньше геля.
4. Помещают в одну пробирку равные количества этих фрагментов, происходящих из разных HPV.
5. Выдерживают пробирку в течение 10 мин в водяной бане на 65 °С, чтобы расплавить агарозу, при сильном встряхивании.
6. Хранят пробирку при —20 °С.
7. Размораживают содержимое пробирки при 65 °С, добавляют 4 мкл этой смеси к 12 мкл дистиллированной воды и денатурируют кипячением в течение 5 мин.

8. Не допуская затвердения агарозы, быстро добавляют в указанном порядке следующие компоненты:
• 5 х смесь для мечения олигонуклеотидов 5 мкл
• dCTP: активность 3000 Ки/ммоль 2 мкл
• Фрагмент Кленова ДНК полимеразы I 1 мкл

9. Инкубируют при 37 °С 30—60 мин.
10. Добавляют 100 мкл ТЭ, перемешивают и помещают на 10 мин в баню на 65 °С.
11. Для отделения меченого зонда от свободных нуклеотидов изготавливают колонку с сефадексом G-50.
12. Для этого силиконированную пастеровскую пипетку объемом 3,5 мл набивают сефадексом G-50.
13. Уравновешивают колонку буфером ТЭ и наносят зонд.
14. Пропускают через колонку пять раз по 200 мкл ТЭ, собирая каждую фракцию элюата в отдельную пробирку.
15. 0пределяют радиоактивность содержимого каждой пробирки с помощью портативного счетчика.
16. Объединяют содержимое двух последних пробирок, отличающееся обычно высокой концентрацией меченого зонда, очищенного от свободных нуклеотидов.
17. Денатурируют зонд кипячением в течение 5 мин и вносят его в предгибридизационную смесь.

5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов

Материалы
• 10 х киназный буфер: 500 мМ трис-HCl, рН 7,6, 100 мМ MgCl2, 50 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ спермидин
• Типоспецифичные олигонуклеотидные зонды: по 10 мкл зондов для HPV6, 11, 16, 18,31 и 33
• [y-32P]-dATP: активность 300 Ки/ммоль (например, фирмы NEN DuPont)
• Полинуклеотидкиназа фага Т4

Методика
1. Смешивают следующие компоненты.
• Типоспецифичные олигонуклеотидные зонды по 1 мкл
• 10 х киназный буфер 2 мкл
• Bidest 9 мкл
• dATP 3 мкл
• Полинуклеотидкиназа фага Т4 1 мкл
Доводят объем дистиллированной водой до 20 мкл

2. Инкубируют не менее 30 мин при 37 С.
3. Фильтруют содержимое пробирки через колонку с сефадексом G-50, как описано в протоколе (при этом прогревание до 65 °С и конечный этап денатурации можно опустить).
4. Вносят зонд в предгибридизационную смесь.
Слабые GP-ПЦР-гибридизационные сигналы могут возникать в результате неспецифического спаривания праймеров с клеточной ДНК, и их не следует рассматривать как указание на наличие новых HPV. Вывод об обнаружении новых типов HPV можно сделать только при наличии позитивных GP-ПЦР-продуктов, дающих сильные гибридизационные сигналы (по сравнению с сигналом на 100 клетках линии SiHa), и отсутствии TS-ПЦР-продуктов. Правильность такой интерпретации была подтверждена результатами секвенирования амплифицированных продуктов (van den Brule et al., в печати).

Чтобы уменьшить риск получения ложноотрицательных результатов, мы периодически отбираем случайным образом группу соскобов и проводим ПЦР, используя глобинспецифичные праймеры как внутренний контроль на возможность амплификации ДНК-мишени. По нашим данным, полученным после ПЦР и электрофореза, р-глобин-негативными оказываются менее 0,1 % соскобов, что говорит о достаточно высоком — с точки зрения возможности проведения ПЦР — качестве мазков. Прямой ПЦР-анализ занимает очень мало времени: 120 образцов можно амплифицировать всего за 2 ч. Таким образом, за неделю один лаборант может провести ПЦР-анализ 500 образцов. Предобработка материала не влияет на скорость анализа, ее можно повысить за счет сокращения продолжительности гибридизации и радиоавтографии. Применение неизотопных методов детекции продуктов ПЦР и автоматизация соответствующих процедур позволят еще больше расширить применение ПЦР для рутинного скрининга HPV в соскобах с шейки матки.

Несмотря на то что две важнейшие проблемы применения ПЦР для массового скрининга — использование неочищенной ДНК и обнаружение еще не секвенированных типов HPV — удалось разрешить, не следует забывать о некоторых других трудностях, как, например, загрязнение материала.

- Читать далее "Особенности скрининга вируса папилломы. Требования к скринингу вируса папилломы"

Оглавление темы "Выявление микроорганизмов и вирусов с помощью ПЦР":
1. Хранение фильтров после гибридизации. Полимеразная цепная реакция
2. Изготовление препаратов для ПЦР. Консервативные и типоспецифичные праймеры вируса папилломы человека
3. Статегия скрининга HPV. Полимеразная цепная реакция на мазках шейки матки
4. Типоспецифичная ПЦР на мазках шейки матки. Блот-гибридизация для выявления вируса папиломы шейки матки
5. Мечение зондов для GP-ПЦР. 5-концевое мечение TS-ПЦР-зондов
6. Особенности скрининга вируса папилломы. Требования к скринингу вируса папилломы
7. Перспективы выявления вируса папилломы. Молекулярные методы обнаружения микроорганизмов
8. Выявление кишечной микрофлоры молекулярными методами. Перенос колоний с селективной среды на твердую подложку
9. Гибридизация нуклеиновых кислот иммобилизованных на фильтрах с ДНК-зондами. Техника гибридизации с ДНК зондами
10. Применение ПЦР для обнаружения патогенных микроорганизмов. Техника выявления микроорганизмов методами ПЦР

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: