Выделение ДНК. Химический синтез ДНК.

ДНК может быть выделена из любого биологического материала: из крови и других жидкостей организма, различных типов тканей и клеток, содержащих ядра. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови. Процесс выделения ДНК состоит из нескольких этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекул ДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе. Оценку качества выделенной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) и А(280) — оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно.

Для научных исследований ДНК не только вьщеляют из биологического материала. но и получают синтетически при использовании ДНК-синтезаторов - приборов для автоматического синтеза ДНК. Принципиальное отличие процесса химического синтеза от биологического состоит в присоединении каждого нового нуклеотида к 5'-гидроксильному концу цепи, а не к З'-концу.

Наиболее распространенным методом химического синтеза ДНК является фосфорамидитный (фосфиттриэфирный) метод. Для синтеза используют модифицированные дезоксирибонуклеозиды. Для предотвращения неспецифического взаимодействия 5'-гидроксильной группы первого нуклеотида до добавления в реакционную смесь второго нуклеотида ее защищают с помощью диметокситритильной (ДМТ) группы. Каждый последующий присоединяемый к растущей цепи нуклеотид добавляется в колонку в виде фосфорамидита, т.е. содержит ДМТ-группу и диизопропиламинную группу на З'-фосфитной группе, защищенную метильным остатком.

выделение днк

Химический синтез необходим для получения одноцепочечных олигонуклеотидов длиной < 50 п.н. Такие олигоиуклеотиды используют для конструирования целых геномов и их фрагментов, в качестве праймеров для амплификации специфических последовательностей и секвенировании ДНК, для сайт-специфического мутагенеза in vitro, в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. Химический синтез применяют при затруднении клонирования гена (если известна аминокислотная последовательность белка). В тех случаях, когда ко-доны гена плохо считываются организмом хозяина, можно синтезировать ген с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), который сохраняет аминокислотную последовательность прежней, но транскрибируется более эффективно.

Для того чтобы синтезировать ген, необходимо каждую из цепей составляющей его последовательности синтезировать отдельно. При большой протяженности гена его синтезируют отдельными фрагментами, которые впоследствии «собирают» с помощью ДНК-полимеразы иДНК-лигазы.

Все молекулярно-генетические методы основаны на использовании различных классов ферментов, два из которых имеют наибольшее значение: ДНК-полимеразы и рестриктазы.

ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК, и для их работы необходима одноцепочечная матричная ДНК с двухцепочечным участком на 3'-конце молекулы и четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dCTP, dGTP и dTTP). ДНК-полимеразы обладают различными видами активности, в том числе и экзонуклеазной в направлении 3' -» 5', что позволяет этим ферментам репарировать дефекты, образовавшиеся при синтезе ДНК. Способность ДНК-полимеразы I E. colt инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом никтрансляции, а также для заполнения брешей при сборке протяженного гена из химически синтезированных олигонуклеотидных последовательностей. Основное свойство ДНК-полимераз- осуществлять синтез ДНК — используют при амплификации изучаемого фрагмента ДНК. Одним из видов амплификации является полимеразная цепная реакция.

- Читать далее "Полимеразная цепная реакция. Принципы ПЦР."

Оглавление темы "Популяционная и молекулярная генетика.":
1. Гены контролирующие индукцию. Индукция и органогенез.
2. Индукция и органогенез мочеточника и почки.
3. Популяционная генетика. Что такое популяция?
4. Закон Харди—Вайнберга. Условия закона Харди—Вайнберга.
5. Инбридинг. Панмиксия. Отсутствие панмиксии.
6. Дрейф генов. Мутационный процесс в популяции.
7. Миграции в популяции. Отбор в популяции.
8. Генетический полиморфизм в популяции. Генетический груз популяции.
9. Выделение ДНК. Химический синтез ДНК.
10. Полимеразная цепная реакция. Принципы ПЦР.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: