Обследование иммунитета при раке молочной железы. Методы выделения антигенных комплексов
Перечень методов, используемых для обследованных больных раком молочной железы, включает в себя, в частности, кожные реакции ГЗТ на туберкулин, ДНХБ, определение иммуноглобулинов классов Л, М и G и метод спонтанного розеткообразования.
Кроме того, для характеристики особенностей иммунного ответа на антигенные компоненты злокачественной опухоли использованы кожные реакции ГЗТ на антигенные комплексы, выделенные из ткани рака молочной железы и из эмбриональных тканей. О степени напряженности гуморального ответа и о его наличии судили но уровню циркулирующих антител к опухолеассоциированным антигенам, выявляемому пефелометрическим методом. Параллельно изучалась картина периферической крови общепринятыми методами.
Материалом для их извлечения служила опухолевая ткань, полученная в результате мастэктомии больных, имевших различную степень распространения опухолевого процесса и не получавших ранее противоопухолевой терапии. Во всех случаях диагноз имел гистологическое подтверждение. Материал хранили при —30°С, все процедуры по выделению комплекса, кроме особо оговоренных, проводили при +4°С.
Опухоль очищали от окружающей ткани, многократно промывали физиологическим раствором и измельчали. Антигенный комплекс получали двумя способами: водно-фенольной экстракцией и водно-солевым извлечением.
1. Метод горячей водно- фенольной экстракции. Измельченную ткань обезжиривали смесью хлороформ-метанол (1:1) в аппарате Сокслета и экстрагировали трехкратным (3 мл на 1 л) объемом дистилпрованной воды 20 минут при 65°С. Экстракт смешивали с равным объемом фенола, насыщенного водой, и перемешивали 20 минут при 65°С. Осадок отделяли центрифугированием (5000 об/мин, 20 минут). Супернатант диализовали против дистиллированной воды в течение 3 суток и концентрировали до небольшого объема. Антигенный комплекс осаждали десятикратным объемом 2%-ного спиртового раствора ацетата натрия. После центрифугирования (2500 об/мин, 20 минут) его трижды промывали смесью эфир-этанол (1:1), растворяли в небольшом объеме дистиллированной воды и лиофилизовали.
2. Метод водно-солевой экстракции. Измельченную ткань обезжиривали десятикратным объемом ацетона или смеси хлороформа с метанолом (9:1), повторяя эту операцию 3—5 раз до получения бесцветного экстракта. Ткань отфильтровывали, промывали небольшим количеством эфира и высушивали в вакууме. Обработанный таким образом материал может храниться месяцами при—10°С. Экстракцию антигенного комплекса проводили водой (А), физиологическим раствором (Б), 0.1 М натрийфосфатным буфером (В), рН 7,0 и 3 М раствором хлористого калия в буфере В (Г). Ткань смешивали с водой или солевым раствором (на 1 г сухой ткани 3—5 мл экстрагирующего раствора) и гомогенизировали (8000 об/мин, 10 минут) в ножевом гомогенизаторе РТ-1 (СССР). Осадок отделяли центрифугированием (8000 об/мин, 30 минут). Процедуру экстрагирования повторяли дважды.
Супернатанты объединяли, и при перемешивании к ним небольшими порциями добавляли равный объем 2 М хлорной кислоты, поддерживая температуру не выше 4°С. При этой же температуре продолжали перемешивание еще 20 минут. Выпавший осадок отделяли центрифугированием (8000 об/мин, 20 минут), супернатант диализировали против проточной воды до рН 6,0, а затем против дестиллированной в течение суток. Образовавшийся осадок удаляли центрифугированием (8000 об/мин, 20 минут) и супернатант лнофилизовали.
Для стерилизации лиофилизованный экстракт, полученный методом водно-фенольной или водно-солевой экстракции, перемешивали с этанолом (10 мл на 1 г экстракта) в течение 1 часа, осадок отделяли цен-рифугировапием (1000 об/мин, 20 минут). Обработку повторяли трижды, затем осадок высушивали в вакууме.
Бактериальную стерильность испытывали посевами на мясопептониый бульон, мясопептонный агар, сахарный бульон и среду Тароцци.
Проверку на токсичность проводили инъекциями препаратов мышам по 0,1 мл антигенного комплекса в концентрации 2 мг/мл внутрикожно и 0,5 мл подкожно.
- Вернуться в оглавление раздела "Онкология"
Оглавление темы "Онкоиммунология":- Антигены рака как маркер. Специфический противоопухолевый иммунитет
- Специфичные опухолевые антигены. Антигенный спектр опухолей
- Эмбриональные антигены опухолей. Классификация эмбриональных антигенов
- Онкоиммунология. Иммунитет онкологических больных
- Иммунодиагностика злокачественных опухолей. Антигенные маркеры опухолей
- Антигены крови при контакте с канцерогенами. Оценка состояния иммунитета в онкологии
- Аллергические реакции на опухоли. Аллергические кожные пробы в онкологии
- Тесты оценки иммунологической реактивности. Оценка гуморального иммунитета
- Направления развития онкоиммунологии. Модели рака молочной железы
- Обследование иммунитета при раке молочной железы. Методы выделения антигенных комплексов