Конфокальная микроскопия: методика, принципы

Конфокальная микроскопия: методика, принципы

Глубина фокуса обычного светового микроскопа сравнительно велика, особенно при использовании объективов малого увеличения. Это означает, что одновременно в фокусе можно видеть препарат на довольно существенную глубину, что вызывает наложение изображений трехмерного объекта.

С другой стороны, при конфокальной микроскопии в фокусе одновременно видна только очень тонкая плоскость препарата. Это явление основано на двух принципах: (1) объект освещается очень небольшим пучком света (тогда как в обычном световом микроскопе образец освещен очень крупным пучком лучей, буквально «утоплен» в нем) и (2) полученное изображение образца должно пройти через мелкое отверстие.
В результате только изображение, возникающее в плоскости фокусировки, достигает детектора, тогда как изображения кпереди и кзади от этой плоскости блокируются.

При этом картины несфокусированных объектов, снижающие качество изображения, теряются, а обнаружение объектов в плоскости фокусировки значительно улучшается, что позволяет локализовать любой компонент препарата со значительно большей точностью, чем при использовании обычного светового микроскопа.

В практических целях в большинстве конфокальных микроскопов используется следующая схема:
1) освещение обеспечивается лазерным источником,
2) поскольку он дает очень маленькую точку, она должна перемещаться по всему образцу (сканирование), чтобы обеспечить наблюдение значительной его части;
3) изучаемый компонент образца должен быть маркирован флюоресцентной молекулой (что означает невозможность изучения обычных срезов);
4) для создания изображения используют свет, который отражается от образца;
5) поскольку отраженный свет захватывается детектором, сигнал можно усилить электронным путем, чтобы его можно было видеть на мониторе.

Так как лишь оченьтонкая плоскость фокусировки (называемая также оптическим срезом) выявляется в каждый момент времени, можно объединить несколько плоскостей фокусировки одного образца и реконструировать их, превратив в трехмерное изображение. Для создания такой реконструкции и реализации многих других параметров конфокальный микроскоп нуждается в мощном компьютерном обеспечении.

Принцип конфокальной микроскопии.
В то время как очень маленькое пятно света, происходящее из одной плоскости среза, проходит через отверстие и достигает детектора, лучи, отраженные от других плоскостей, блокируются пластинкой.
Таким образом, в данное время только одна тонкая плоскость образца находится в фокусе. конфокальная микроскопия

Конфокальный микроскоп (практическая схема).
Свет, испускаемый лазерным источником, попадает в образец и отражается от него. Разделитель пучка света направляет его в отверстие и детектор.
Свет, исходящий от компонентов образца, расположенных выше или ниже плоскости фокусировки, блокируется пластинкой.
Лазер сканирует образец таким образом, что можно наблюдать значительную его часть.

Видео микроскопические методы исследования: световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопии

- Читать далее "Флюоресцентная микроскопия: методика, принципы"

Оглавление темы "Методы исследования в гистологии":