Существует два способа переноса нуклеиновых кислот на фильтры:
а) прямое нанесение растворов нуклеиновых кислот на фильтр (дот- или слот-блоты);
б) перенос нуклеиновых кислот на мембранные фильтры после их фракционирования в агарозном геле (Саузерн- или Нозерн-блоты).

При переносе ДНК вторым способом обрабатывают препарат рестриктирующими ферментами, проводят гель-электрофорез фрагментов и переносят их из агарозного геля на мембранный фильтр за счет капиллярных сил. Этот метод был разработан Е. Саузерном, и получаемые с его помощью образцы получили название Саузерн-блотов.

Нативная РНК, обладающая вторичной структурой, не способна эффективно связываться с мембранными фильтрами, поэтому ее необходимо сначала денатурировать (перевести в полностью одноцепочечную форму) и лишь потом проводить фракционирование с помощью гель-электрофореза и перенос из агарозного геля на мембранный фильтр. Этот метод получил название Нозерн-блоттинга.

Образцы ДНК или РНК на фильтре необходимо фиксировать, чтобы предотвратить их смывание во время гибридизации и при последующих процедурах. Для этого нуклеиновые кислоты пришивают к найлоновому фильтру с помощью УФ-света или к нитроцеллюлозному фильтру «прожариванием» при 80 С в вакууме.

Кинетика блот-гибридизации определяется в основном иммобилизованными на фильтре нуклеиновыми кислотами, однако на нее можно повлиять, повысив концентрацию зонда в буфере для гибридизации или добавив в этот буфер анионные полимеры с большой мол. массой (типа декстрансульфата). В любом случае кинетику процесса трудно предсказать, основываясь только на теоретических предпосылках, в частности потому, что невозможно точно определить концентрацию фиксированной на фильтре нуклеиновой кислоты и ее доступность для зонда. Отметим лишь, что гибридизация в течение ночи (16 ч) в присутствии 10% декстрансульфата позволяет выявить уникальные гены и малые количества мРНК.

Процесс блот-гибридизации ДНК состоит из двух этапов: нанесения ДНК на фильтры и собственно гибридизации.
Для нанесения ДНК на фильтры разработано большое число различных методов и их модификаций, однако некоторые из них требуют применения специального оборудования или мембранных фильтров. Методы, описанные в протоколах, достаточно просты, эффективны и универсальны. Кроме того, они высокочувствительны и дают воспроизводимые результаты.

Перенос ДНК на фильтры по методу Саузерна

Материалы
• 10 х ТВЭ: 0,9 М оснбвный трис, 0,9 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА. рН доводят до 8,1-8,2 сухой борной кислотой
• Бромистый этидий: 10мг/мл
• Буфер для нанесения: 0,25% бромфеноловый синий, 40% сахароза в 1 х ТВЭ
• 0,25 М НС1
• Буфер для денатурации: 1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH
• Буфер для нейтрализации: 0,5 М трис-HCI, рН 7,0, 3 М NaCl
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Мембранные фильтры (нитроцеллюлозные или найлоновые)
• Агароза

Методика
1. Обрабатывают ДНК рестриктирующими эндонуклеазами согласно инструкции фирмы — изготовителя фермента. Обычно для полной рестрикции достаточно инкубации препарата с ферментом в течение ночи при концентрации последнего 5 ЕД на 1 мкг ДНК. Чтобы избежать появления неспецифичной активности, необходимо правильно подобрать буфер для рестрикции.
2. Фрагментированную ДНК фракционируют с помощью электрофореза в агарозном геле (вместе с маркерами мол. массы) при градиенте напряжения 1—2 В/см. Длина геля зависит от диапазона длин разделяемых фрагментов. Если этот диапазон достаточно широк, то используют длинный (20 см) гель, а фрагменты близкого размера можно фракционировать в сравнительно коротком (10 см) геле. Обычно для разделения фрагментов длиной от 1 до 15 т.н. используют гели, содержащие 0,8—1 % агарозы. В случае фрагментов небольшого размера (400—800 нуклеотидов) необходимо использовать агарозу большей концентрации (1,2-1,4%). И напротив, для разделения больших (15—30 т.н.) фрагментов нужна более низкая концентрация агарозы (0,5— 0,7%).
3. После электрофореза гель фотографируют. При этом неплохо положить рядом с гелем линейку, чтобы легче было определять подвижность маркерных фрагментов.

4. Осторожно, чтобы не повредить гель, перекладывают его в пластиковую кювету верхней стороной вниз и несколько раз ополаскивают дистиллированной водой.
5. Заливают гель на 30 мин 0,25 М НС1, затем несколько раз ополаскивают его водой.
6. Денатурируют ДНК, инкубируя гель в течение 35 мин в буфере для денатурации при слабом покачивании кюветы.
7. Повторяют денатурацию в свежей порции буфера в течение 20 мин; ополаскивают гель несколько раз водой.

8. Нейтрализуют гель в двух сменах буфера для нейтрализации (по 15 мин в каждой смене).
9. Во время обработки геля вырезают фильтр (нитроцеллюлозный или найлоновый) точно такого же размера, как гель.
10. Замачивают фильтр в воде и переносят его в 20 х SSC. Собирают прибор для переноса и накрывают его полиэтиленовой (пластиковой) пленкой.
11. В пленке вырезают окошко точно такого же размера, как гель, и заливают его небольшим количеством 20 х SSC. Это уменьшит вероятность образования пузырьков воздуха между гелем и фитилем.

12. Помещают гель в окошко и наливают на него небольшое количество 20 х SSC.
13. Накладывают на гель мембранный фильтр так, чтобы между гелем и фильтром не было пузырьков воздуха.
14. На мембранный фильтр кладут два листа фильтровальной бумаги ватман 3ММ, затем — стопку фильтрованной бумаги (или бумаги для блоттинга).
15. Поверх стопки кладут стекло и груз весом около 500 г.

16. Проводят блоттинг в течение 12— 16 ч.
17. Переносят гель вместе с фильтром на лист сухой фильтровальной бумаги гелем вверх и мягким карандашом отмечают положение на фильтре геля и гребенки. Снимают гель и окрашивают его бромистым этидием (0,5 мкг/мл) для проверки эффективности блоттинга.
18. Промывают фильтр несколько раз в 5 х SSC, переносят его на лист сухой фильтровальной бумаги и срезают один из уголков фильтра.
19. Нитроцеллюлозный фильтр прожаривают при 80 С в вакууме в течение 2 ч, а найлоновый облучают УФ-светом. Для пришивания ДНК к найлоновому фильтру можно использовать как специальный прибор для образования УФ-сшивок, так и УФ-трансиллюминатор, облучая фильтр в течение 3—5 мин (при этом сторона фильтра, на которую нанесена ДНК, должна быть обращена к источнику УФ-света).

20. Обработанный таким образом фильтр можно хранить при 4 С; нитроцеллюлозные фильтры необходимо хранить под вакуумом.
- Необходимое для кислотной апуринизации время зависит от концентрации агарозы, толщины геля и размера анализируемых фрагментов. Нужно исключить излишнюю апуринизацию.
- Важно после переноса удалить с фильтра все следы агарозы.

- Читать далее "Изготовление дот-блотов ДНК. Техника блот-гибридизации ДНК"