Обычно последовательность-мишень является членом гетерогенной популяции разных нуклеиновых кислот. В качестве зондов могут использоваться как ДНК, так и РНК, а пометить их можно радиоактивными изотопами или нерадиоактивными молекулами-свидетелями, используя химические или ферментативные методы. ДНК-зонды обычно являются двухцепочечными молекулами и перед гибридизацией их необходимо денатурировать, например тепловым способом.

РНК-зонды — это, как правило, одноцепочечные молекулы и их денатурация в принципе необязательна, хотя и желательна, поскольку это приводит к разрушению вторичной структуры РНК и увеличению числа способных к гибридизации фрагментов. При гибридизации в растворе оптимальной для ренатурации нуклеиновых кислот является температура примерно на 25 С ниже температуры плавления (Тт) гибридной молекулы. Тт двухцепочечной молекулы (она определяется как температура, при которой денатурировано 50% молекул) зависит от GC-содержания дуплекса (в %), его длины (в п.н.), концентрации (в М) моновалентных катионов (например, Na+) и концентрации формамида (в %) в реакционной смеси.
Эту зависимость можно представить следующей эмпирической формулой:
Тт - 81,5 + 16,6 log М + 0,41 (% G + С) - 0,72 (% формамида) - 500/Размер (п.н.).

Данная формула дает лишь примерное значение Тт. Точную ее величину необходимо определять экспериментально, поскольку она зависит не только от количества остатков гуанина и цитозина, но и от их распределения в молекуле. Необходимо внести поправку и на образование неполностью комплементарных (несовершенных) гибридов: обычно при наличии 1 % неспаренных нуклеотидов Тт снижается на 0,5—1,5 С.

В зависимоти от жесткости условий, в которых проводятся гибридизация и отмывание препаратов после гибридизации, задается доля образующихся и сохраняющихся несовершенных гибридов. Гибридизацию обычно проводят в относительно мягких условиях (например, при температуре на 25 °С ниже Тт для полностью комплементарных гибридов), при которых могут образовываться гибриды между частично гомологичными последовательностями. Отмывают препараты в жестких условиях, обеспечивающих сохранение только более совершенных гибридов.

Очень часто гибридизацию проводят не в растворе, а на фильтрах (блот-гибридизация) или in situ. Кинетика образования гибридных молекул и их Tm в этих случаях отличаются от таковых для растворов, так что время гибридизации, условия ее проведения и условия промывания приходится определять эмпирически. Более полно принципы молекулярной гибридизации рассмотрены в предыдущих главах и в работе.

Метод блот-гибридизации позволяет выявить аномальные (измененные или экзогенные) нуклеотидные последовательности в любом клиническом образце, из которого можно выделить нуклеиновые кислоты. При этом с помощью блотов, полученных после фракционирования образцов методом гельэлектрофореза, удается не только выявить ту или иную нуклеиновую кислоту, но и обнаружить изменения в размере молекул, свидетельствующие о структурных нарушениях. Прямое нанесение нуклеиновых кислот на мембранные фильтры (дот-блот) позволяет ответить только на один вопрос: есть ли в данном образце искомая последовательность. Чтобы обнаружить изменения в уровне экспрессии генов, обычно используют Нозернблоты (анализ РНК). Этот метод позволяет также зарегистрировать изменение длины мРНК-транскриптов.

Все эти нарушения могут существенно повлиять как на количество белкового продукта, образующегося при трансляции мРНК, так и на его биологическую активность. Возможности такого анализа очень хорошо иллюстрирует изучение мутаций в гене ретинобластомы (Rb), в результате которых либо блокируется экспрессия гена, либо образуются аномальные мРНК. Инактивация этого гена играет важную роль в этиологии различных форм рака у человека. Сходную роль в патогенезе рака играет усиление экспрессии онкогенов или образование продуктов онкогенов с нарушенной структурой; эти аномалии тоже можно выявить с помощью описанных выше методов. Для изучения структуры определенного локуса обычно используют блот-гибридизацию по Саузерну (анализ ДНК). При наличии соответствующих рестриктирующих эндонуклеаз структурные изменения в генах можно выявить метолом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Кроме того, с помощью рестриктаз-изошизомеров, узнающих метилированные и не метилированные нуклеотиды (например, 5-метилцитозин), можно определить степень метилирования данного гена или обнаружить изменения в характере его метилирования. Блот-гибридизация по Саузерну позволяет выявить структурные нарушения в генах при таких наследственных заболеваниях человека, как серповидноклеточная анемия, талассемия, муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшена и т. д. Этот метод дает возможность также выявить активацию онкогенов в результате их перестроек, точковых мутаций или амплификации либо инактивацию генов — супрессоров опухолей при перестройках в молекуле ДНК, точковых мутациях и делециях.

Методом блот-гибридизации можно обнаружить в клинических образцах те или иные инфекционные агенты: выявлением либо их геномной ДНК с помощью ДНК-блотов, либо соответствующих РНК-транскриптов с помощью РНК-блотов. Более того, используя в качестве зондов фрагменты геномов, высокоспецифичные в отношении определенных штаммов, можно идентифицировать эти штаммы.

- Читать далее "Блот-гибридизация нуклеиновых кислот. Блот-гибридизация ДНК"