Для получения 3-меченых олигонуклеотидных зондов можно использовать терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT) и 32Р-, 35S- или 3Н-нуклеотиды либо нерадиоактивные метки (биотин или дигоксигенин). Присоединение к 3-концу олигонуклеотида одного или нескольких нуклеотидов, катализируемое TdT, происходит в присутствии двухвалентных катионов и ингибируется хелатирующими агентами типа ЭДТА. В присутствии Mg2+ фермент катализирует присоединение только одного или двух нуклеотидных остатков, а при замене ионов магния на ионы кобальта эффективность реакции и число присоединяемых нуклеотидных остатков повышаются.

Если ставится задача присоединить к 3-концу только один меченый нуклеотид, то используется дидезоксинуклеозид-5-трифосфат. Он не содержит 3-гидроксильной группы, так что после присоединения первого остатка полимеризация сразу останавливается. Вскоре в продаже появится реактив dig-11-ddUTP фирмы Boehrinder Mannheim, что позволит включать в олигонуклеотиды один 3 -концевой нерадиоактивно меченный остаток.

При включении нескольких нуклеотидов метку надо вводить в ct-положение фосфатной группы или во внутренний остаток основания. Зонды не должны содержать на конце dTTP, поскольку этот «хвост» может гибридизоваться с роlу(А)+-участком мРНК, что приведет к повышению фона. Аналогичным образом, зонды, содержащие на конце dATP, могут гибридизоваться с ро1у(Т)-участками в геномной ДНК человека. Длина меченого «хвоста» (и удельная радиоактивность полученного зонда) определяется относительной молярной концентрацией 3-концов и dNTP.

В условиях, описанных в протоколе, в состав хвоста (длиной примерно 100 нуклеотидов) включается около 60% меченого предшественника dCTP. Эффективность включения dCTP несколько ниже, и в этом случае необходимо использовать большие концентрации фермента и увеличивать время реакции.

3-концевое мечение с использованием терминальной лезоксинуклеотидилтрансферазы

Радиоактивное мечение
Материалы
• 5 х TdT-буфер: 5 мМ СоСl2, 500 мМ какодилат натрия, рН 7,0, 1мМДТТ
• dCTP (удельная радиоактивность 5000 Ки/ммоль; 185 ТБк/ммоль)
• Олигонуклеотид: 20 нг/мкл (для олигонуклеотида из 20 звеньев это соответствует 3 пмолям 3 -концов)
• Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза: 5 ЕД/мкл NB! Какодилат — это ядовитое вещество, содержащее мышьяк. Необходимо избегать его попадания на кожу.

Методика
1. В помещенную в лед микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы:
• 5 х TdT-буфер 10 мкл
• Олигонуклеотид 1 мкл (3 пмоля 3 -
• Вода 18 мкл
• dCTP 20 мкл (200 мкКи)
• TdT 1 мкл (5ЕД)

2. Содержимое пробирки перемешивают и быстро центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g. Инкубируют при 37 С в течение 45-60 мин.
3. Останавливают реакцию прогреванием в течение 5 мин при 65 °С. Реакционную смесь охлаждают во льду.
4. Невключившиеся нуклеотиды удаляют с помощью гель-электрофореза, ЖХВР или ТСХ.

- Читать далее "Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов"