Гибридизационный сигнал представляет собой скопление отдельных или сливающихся зерен (если используется изотопная метка) либо окрашенный преципитат, локализованный в цитоплазме, ядре или перинуклеарной области. При выявлении вируса папилломаы человека обычно наблюдается фокальное окрашивание: одни клетки отчетливо позитивные, другие негативные. Фоновое окрашивание очень слабое, диффузное и неравномерное. Если вирусные последовательности локализуются в ядре, то обычно видны два типа сигналов: диффузно распределенные зерна и плотные внутриядерные скопления зерен (если используется изотопная метка). Интенсивность окрашивания можно использовать в качестве грубого критерия для оценки содержания ДНК-мишени в препарате. Высокая плотность метки говорит о наличии от нескольких сотен до тысячи и более копий искомой последовательности.

Плотность зерен после радиоавтографии можно оценить либо чисто визуально (конечно, это будет очень грубая оценка), либо путем прямого подсчета зерен, что требует много времени. В последнее время для этих целей используют автоматические анализаторы изображения, дающие высокое разрешение.

Число копий вирусного генома в одной и той же ткани варьирует, что затрудняет сравнение чувствительности разных методов гибридизации. Единственная возможность — использование клеточных линий, содержащих известное число копий ДНК-мишеней на клетки. Сравнение проводили на инфицированных вирусом папилломы человека (HPV) клеточных линиях CaSki (500-600 копий ДНК HPV 16), HeLa (20-50 копий ДНК HPV 18) и SiHa (1 копия ДНК HPV 16). Оказалось, что чувствительность метода при работе с ДНК-зондами, меченными 35S, варьирует от 20 до 100 копий на клетку, а с биотинилированными ДНК-зондами — от 800 копий на клетку до величин, сравнимых или даже более высоких, чем для зондов, меченных 35S. Такая высокая вариабельность в последнем случае обусловливается не природой метки, а тем, что используются разные системы детекции. Метод гибридизации с РНК-зондами более чувствителен, чем с ДНК.

Наиболее распространные проблемы, возникающие при гибридизации in situ с радиоактивными и биотинилированными зондами. При работе с биотинилированными зондами эти проблемы могут быть связаны с наличием в препарате эндогенного биотина, особенно в нервной, опухолевой и железистой тканях. Их можно решить, последовательно инкубируя срезы перед гибридизацией со стрептавидином (1 мг/мл, 20 мин) и биотином (0,1 мг/мл, 20 мин). Неспецифическое фоновое окрашивание, обусловленное присутствием в тканях гликогена, предотвращают предварительной обработкой срезов амилазой. Эндогенную кислую фосфатазу блокируют левамизолом, при этом для практически полного блокирования достаточно присутствия левамизола в растворе субстрата в концентрации 10 мМ.

Ложноположительное окрашивание может обусловливаться также гибридизацией с клеточной ДНК человека последовательностей вектора на основе бактериальной плазмиды, который использовался для клонирования зонда. Имеются также много численные данные о гибридизации между плазмидой pBR322 и бактериальной ДНК, например ДНК Candida albicans. Чтобы обойти эти трудности, следует провести дополнительную очистку препарата зонда от векторной ДНК. Биоптаты, использующиеся в качестве отрицательного контроля (например, при выявлении вирусов), должны быть получены от больных, неинфицированность которых проверена по четким клиническим, серологическим и гистологическим критериям. Основной недостаток метода гибридизации in situ состоял в том, что его чувствительность до недавних пор не превышала 20-100 генов или эквивалентных им геномных последовательностей на клетку. В настоящее время удается обнаружить от 2,5 до 12 копий HPV-геномов на клетку, но инфекция может развиться и при меньшем числе копий, а выявить ее с помощью гибридизации in situ не удается. По-видимому, дело здесь не в самих зондах, а в невозможности «генерировать» и зарегистрировать гибридизационный сигнал.

Методы гибридизации in situ позволяют диагностировать многие вирусные инфекции. С их помощью можно обнаруживать вирусные нуклеиновые кислоты и определять их содержание, а значит, проводить эпидемиологические исследования на молекулярном уровне. Благодаря своей высокой специфичности и быстроте ГИС является ценным дополнением к традиционным методам, использующимся в вирусологии: инфицированию подходящих клеток, размножению вируса в культуре ткани, электронной микроскопии образцов ткани, серологическому анализу вирусных антигенов. Большое преимущество метода состоит в том, что он позволяет обнаруживать микроорганизмы при латентной инфекции (например, вирус герпеса) или микроорганизмы, которые трудно (аденовирусы и вирусы JC) или пока невозможно (вирус папилломы и вирус гепатита В) культивировать in vitro. Кроме того, для гибридизации можно использовать препараты, фиксированные формалином, или эпителиальные клетки слизистой, которые не составляет труда получить. В продаже появляются все новые зонды для гибридизации, и, по-видимому, все больше лабораторий будут использовать этот метод в диагностических целях.

- Читать далее "Диагностика вируса папилломы человека. Диагностика цитомегаловируса и вируса простого герпеса"