Чтобы убедиться в специфичности гибридизации in situ, необходимо поставить контрольные опыты, зависящие от используемого зонда и типа мишени. При гибридизации с выделенной РНК или рестрицированной ДНК, полученной после гель-электрофореза и переноса на твердую подложку (Саузерн- или Нозерн-блоттинг), должна обнаруживаться гибридизация с молекулами известного, точно заданного размера. Эти методы, сходные с Вестерн-блотгингом, который используют для контроля специфичности антител, позволяют убедиться в специфичности зонда. Гибридизация с положительными контрольными срезами должна давать ожидаемое распределение метки. При постановке отрицательного контрольного опыта из процедуры гибридизации исключают зонд и используют ткани, заведомо не содержащие искомых нуклеиновых кислот. Специфичность гибридизационного сигнала проверяют, анализируя два серийных среза на одном и том же предметном стекле. При наличии подходящих антител одновременное проведение ГИС и иммуноцитохимического анализа на одном или нескольких серийных срезах позволяет убедиться в том, что мРНК и ее продукт локализованы в одних и тех же клетках. Если иммуноцитохимический анализ невозможен, то приходится проводить гибридизацию с зондами, содержащими разные специфические фрагменты. Отрицательный контрольный опыт может быть поставлен с неспецифическими векторными последовательностями или смысловым РНК-зондом. Используют также срезы, обработанные РНКазой, чтобы показать, что гибридизация имеет место лишь при наличии в ткани РНК. Чтобы оценить степень неспецифического окрашивания, все контрольные срезы следует окрашивать одновременно.

Процедуру, описанную в протоколе, мы используем как для культур клеток, так и для соскобов. Метод дает очень низкий фон. Для улучшения морфологии клеток можно провести многократное обезвоживание, если же морфология несущественна, соответствующие процедуры исключают и перед гибридизацией просто проводят мягкую обработку клеток протеиназой К в концентрации 0,1 мкг/мл в ФСБ.

Гибридизация in situ ДНК цитологических препаратов с S-зондами

Материалы
• 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• 0,1 М триэтаноламин-HCl, рН 8,0
• Уксусный ангидрид

Методика
1. Вынимают препараты из холодильника и прогревают их до комнатной температуры. Используют штативы на 20—48 стекол.
2. Инкубируют препараты в 2 х SSC при 70 °С в течение 30 мин.
3. Проводят дегидратацию в двух сменах 70% этанола при комнатной температуре по 10 мин.
4. Переносят стекла в 95% этанол на 5 мин, затем высушивают их на воздухе.

5. Помещают стекла в 0,1 M триэтаноламин, хорошо перемешивают и добавляют уксусный ангидрид (3 мкл на 300 мл триэтаноламина). Инкубируют 10 мин при комнатной температуре.
6. Промывают стекла в 2 х SSC в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Проводят дегидратацию в двух сменах 70% этанола, по 10 мин в каждой, и в двух сменах 95% этанола, по 5 мин в каждой, затем высушивают препараты на воздухе.
8. Помещают стекла на 3 мин в 70 мМ NaOH.

9. Проводят дегидратацию в трех сменах 70% этанола, по 10 мин в каждой, и в двух сменах 95% этанола, по 2 мин в каждой, затем высушивают препараты на воздухе.
10. Готовят гибридизационную смесь так, как это описано в протоколе 5.8, Наносят нужное количество смеси на препараты и накрывают их покровными стеклами.
11. Денатурируют препараты в течение 3—5 мин в термостате при температуре примерно 110 С. Для гарантии температуру у поверхности стекол измеряют термометром (82 °С). Оставляют препараты для гибридизации при 37—42 °С на 40 ч.
12. Снимают покровные стекла, помещают препараты в штатив и промывают их в двух сменах прогретого до 37 °С 2 х SSC, по 10 мин в каждой.

13. Промывают препараты в трех сменах прогретого до 37 °С 2 х SSC, по 10 мин в каждой.
14. Проводят дегидратацию в двух сменах 70% этанола, по 10 мин в каждой, и в 95% этаноле 5 мин, затем высушивают препараты на воздухе.
15. Проводят радиоавтографию в соответствии с протоколом. Для клеток время экспозиции должно быть больше, чем для срезов.

- Читать далее "Гибридизация ДНК вирусов в гистологических срезах. Гибридизация in situ ДНК парафиновых срезов с S-зондами"