Отжиг высокоповторяющихся последовательностей происходит быстро, и время гибридизации может быть небольшим. Так, при высоком титре вируса и выявлении хромосомоспецифичных высокоповторяющихся последовательностей для гибридизации достаточно двух часов. Для низкокопийных последовательностей процесс занимает гораздо больше времени, в некоторых случаях до 40 ч, но обычно гибридизацию проводят в течение ночи. Оптимальное время подбирают опытным путем, используя для каждой комбинации зонд/мишень свои положительные и отрицательные контроли.
В состав гибридизационной смеси входят две группы компонентов: абсолютно необходимые и те, без которых можно обойтись.

К числу необходимых компонентов относятся моновалентные катионы (обычно ионы натрия), декстрансульфат, гибридизационный буфер и меченый зонд. Концентрация моновалентных катионов и формамида определяется жесткостью условий гибридизации, а применение декстрансульфата связано с тем, что за счет молекулярного вытеснения он увеличивает эффективную концентрацию зонда; для достижения максимального эффекта используют декстрансульфат с мол. массой более 8000. Меченый зонд должен иметь подходящий размер и присутствовать в нужной концентрации. Если зонд будет слишком большим, он не сможет проникнуть через клеточный матрикс даже после протеолитической обработки. Мы считаем, что оптимальный размер зондов, полученных методом ник-трансляции, — 200-400 п.н. При меньшей длине повышается уровень фоновой гибридизации вследствие неспецифической абсорбции зонда клеточными структурами. Подбирая концентрацию зонда, необходимо соблюдать баланс между временем и полнотой гибридизации, с одной стороны, и отношением сигнал/шум, с другой. При этом необходимо учитывать, что гибридизация зонда с последовательностью-мишенью — это реакция второго порядка, но в случае гибридизации с ДНК-мишенями на нее накладывается отжиг последовательности-мишени самой на себя. В результате при повышении концентрации зонда до 1—2 нг/мкл происходит насыщение как при анализе мРНК, так и при анализе ДНК. В то же время неспецифическое связывание зонда происходит без насыщения, и, таким образом, оптимальной является концентрация зонда, при которой наблюдается насыщение специфической гибридизации. Обычно мы работаем при концентрации 2 нг/мкл; при меньших концентрациях существенно снижается чувствительность метода.

Для уменьшения неспецифической гибридизации в гибридизационную смесь иногда добавляют избыточное по отношению к зонду количество немеченой ДНК человека (зонды вирусного происхождения) или ДНК спермы лосося (если в качестве зонда используется геномная ДНК человека), а также другие вещества, например фиколл и поливинилпирролидон. Их применение определяется условиями конкретного эксперимента, которые мы обсудим в соответствующих разделах.

Денатурация и гибридизация

Материалы
• Формамид
• Ионообменная смола Bio-Rad AG501-X8, 20-50 меш
• Декстрансульфат
• 20 х SSC: 3 М NaCI, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
• Меченый зонд
• Буфер ТЭ
• Чашки Терасаки (Gibco/Nunc, UK)

Методика
А. Приготовление гибридизационного буфера (ГБ)
1. Деионизуют формамид, перемешивая в течение 45 мин 50 мл формамида с 5 г ионообменной смолы. Затем дважды профильтровывают формамид через бумажный фильтр ватман N° 1 и хранят его порциями при —20 °С.
2. Смешивают:
• деионизованный формамид 5 мл
• 50% (в/о) декстрансульфат 1 мл
• 20 х SSC 1 мл
3. Доводят рН буфера до 7,0 с помощью 5 М НС1 и хранят его при 4 С.

Б. Денатурация и гибридизация
1. На каждые 7 мкл ГБ добавляют 10—20 нг меченого зонда.
2. К получившейся гибридизационной смеси (ГС) можно добавить те компоненты, которые не являются необходимыми для гибризидации).
3. К полученной ГС добавляют ТЭ, доведя ее объем до 10 мкл на каждые 7 мкл исходного ГБ,
4. На каждый срез капают от 5 до 20 мкл полученной смеси.
5. Покрывают срез покровным стеклом.
6. Помешают стекла со срезами в чашки Терасаки (по 2 среза в чашку).
7. Проводят денатурацию либо в вентилируемом сушильном шкафу при 95 °С в течение 15 мин, либо в микроволновой печи. Время денатурации в последнем случае подбирают для каждой печи опытным путем.
8. Проводят гибридизацию в суховоздушном термостате при 42 С в течение 2—16 ч.

- Читать далее "Отмывание препаратов после гибридизации. Методика отмывания препаратов после гибридизации"