Необходимость в денатурации определяется типом зонда и нуклеиновой кислоты-мишени. Если объект исследования — двухцепочечная ДНК и используется двухцепочечный зонд, необходимо денатурировать обе молекулы. Денатурировать одноцепочечную мРНК и рибо-зонды нет необходимости, но на самом деле денатурация приводит к усилению сигнала — возможно, в результате разрушения вторичной структуры. Для денатурации используют как химические, так и физические методы. Так, при гибридизации на фильтрах обычно проводят щелочную денатурацию, однако (особенно при неизотопной ГИС) такая денатурация может вести к разрушению эфирной связи между нуклеотидом и молекулой-свидетелем. Поэтому мы вместо химической используем термоденатурацию, нагревая образец или обычным способом, или в микроволновой печи. Денатурацию зонда и нуклеиновой кислоты-мишени можно проводить раздельно (как в случае гибридизации нуклеиновых кислот с иммобилизованной на фильтре ДНК) или зонд можно добавить к срезу до денатурации, а затем одновременно денатурировать и зонд, и последовательность-мишень. Последний метод обычно применяют при ГИС ДНК—ДНК, но он столь же эффективен и при анализе мРНК. Денатурацию обычно проводят в присутствии формамида и солей. Формамид ослабляет внутримолекулярные водородные связи в зонде и в последовательности-мишени, что позволяет снизить температуру денатурации и гибридизации. Проще всего одновременно денатурировать зонд и последовательность-мишень путем добавления зонда к мишени в соответствующей реакционной смеси.

Гибридизация и определение жесткости ее условий. Если зонд и последовательность-мишень денатурируют одновременно, то для проведения гибридизации достаточно просто снизить температуру смеси ниже температуры плавления гибрида зонд/мишень и в этих условиях выдержать образец в течение 2-16ч.

При однофазной гибридизации (т. е. при гибридизации в растворе) оптимальная температура ренатурации примерно на 25 °С ниже температуры плавления (Тт) гибридной молекулы. Тт двухцепочечной молекулы ДНК — это температура, при которой 50% дуплексов денатурировано; она зависит от GC-содержания дуплекса, его длины в парах нуклеотидов (L), концентрации моновалентных катионов (М) и содержания в реакционной смеси формамида (F). Зависимость Tm от этих параметров можно описать с помощью формулы, полученной на основании экспериментов по ренатурации ДНК в растворе:

Тт = 81,5 + 16,6 log М + 0.41 (%GC) - 0,72F- 650/L.
В случае гибридов с неправильным спариванием необходимо скорректировать формулу. Степень ренатурации зависит от условий гибридизации и отмывания образца. Температура плавления несовершенных дуплексов (Тт) ниже Тт полностью комплементарных гибридов и оценивается по формуле

Тт = Тт - а(% некомплементарных нуклеотидов), где а варьирует от 0,5 до 1,4 С. Точная ее величина зависит от нуклеотидной последовательности гибридной молекулы, поскольку некомплементарность в GC-богатых участках приводит к большему снижению Тт, чем в АТ-богатых: для poly(AT) a = 0,5, для poly(GC) — 1,4, а для большинства других последовательностей а находится между этими двумя значениями. В результате, если гибридизацию проводить при температуре между Тт и Т'т, то не полностью комплементарные последовательности гибридизоваться не будут. Напомним, однако, что скорость отжига максимальна при температуре Тт — 25 °С и уменьшается по мере приближения к Tm. Таким образом, нужно пойти на некий компромисс, в результате которого общепринятые «жесткие» условия (гибридизация в 50% формамиде, 2 х SSC при 37-42 °С) будут соответствовать температуре от Tm —12 до Тт -19 °С. В этих условиях отжиг идет достаточно быстро, но для гибридов, комплементарных менее чем на 83-88% (при а = 1), гибридизация отсутствует. Более жесткие условия создают, отмывая препарат после гибридизации при температуре, более близкой к Tm.

При дальнейшем обсуждении условий проведения неизотопной ГИС речь будет идти о зондах, полученных методом ник-трансляции, и о парафиновых срезах.

До сих пор мы считали, что нуклеиновые кислоты в тканях и клетках ведут себя точно так же, как в растворе, что не соответствует действительности. Например, цитоскелет затрудняет диффузию зонда к последовательности-мишени; есть и другие ограничивающие подвижность факторы. В тканях, фиксированных альдегидами, диффузия еще более замедляется вследствие образования сшивок между нуклеиновыми кислотами и между нуклеиновыми кислотами и белками. Поскольку неизотопная ГИС широко используется для исследования фиксированных в формалине архивных препаратов, ясно, как важно учитывать любые отклонения от поведения нуклеиновых кислот в растворе. Так, денатурацию в фиксированных альдегидами тканях или клетках в 2 х SSC и 50% формамиде нужно проводить при температуре 90—95 С, хотя из приведенных выше формул получается Тт, равное 58 С (при GC-содержании 50%). Такие различия характерны именно при альдегидной фиксации; при фиксации клеток в смеси спирт/кислота денатурацию проводят при более низкой температуре.

Возможность с помощью ГИС различать близкородственные последовательности можно оценить, используя уравнения, описывающие кинетику ренатурации нуклеиновых кислот в растворе. Однако в любом случае конечная цель анализа состоит в том, чтобы доказать наличие или отсутствие гибридизации независимо от того, удовлетворяют ли экспериментальные условия ее проведения тем, которые используются при математическом анализе кинетики ренатурации в растворе. Эти условия необходимо подбирать опытным путем, ставя контрольные опыты, позволяющие исключить перекрестную гибридизацию между родственными последовательностями. Особенно важно это при выявлении вирусных ДНК, для которых был опытным путем определен «тканевой эквивалент» Tm(Tm).

Более полное описание процесса гибридизации и влияющих на него факторов можно найти в книге. Использованные там условия (50% формамид, 2 х SSC, 42 С) соответствуют температуре гибридизации Тт — 12 °С|. Жесткость условий можно повысить, увеличив концентрацию формамида, снизив концентрацию солей и повысив температуру.

- Читать далее "Время гибридизации. Гибридизационная смесь"