После того, как молекула-свидетель выбрана, ее нужно включить в зонд. Существуют разные виды зондов и способы мечения, и окончательный их выбор определяется целями эксперимента.

Двухцепочечные ДНК-зонды используются прежде всего для выявления ДНК, но могут применяться и для гибридизации с РНК. Обычно они представляют собой бактериальные плазмиды со встроенной специфической последовательностью. Для мечения двухцепочечной ДНК используются два метода.

Ник-трансляция. Этот метод чаще всего применяется для выявления ДНК, поскольку соответствующие зонды легко получать и с ними удобно работать. Метод включает внесение в двухцепочечную ДНК случайных разрывов, в результате чего образуются меченые фрагменты разной длины с разным соотношением между векторной ДНК и вставкой. Предполагается, что такие фрагменты при отжиге соединяются друг с другом по перекрывающимся последовательностям, образуя сеть, что приводит к усилению сигнала в месте локализации последовательности-мишени и повышению чувствительности метода. Альтернативный метод состоит в рестрикционном вырезании зонда из плазмиды. Теоретически это предотвращает неспецифическое связывание вектора при гибридизации, но наш опыт показывает, что более высокую чувствительность обеспечивает мечение вектора с встроенным зондом, а не вырезанного зонда. Неспецифическое связывание вектора можно учесть, проведя соответствующий контрольный опыт.

Наборы для ник-трансляции можно приобрести у нескольких фирм (например, Gibco BRL, UK). При работе с ними необходимо строго следовать рекомендациям фирмы-изготовителя. Для удаления невключившихся нуклеотидов мы используем переосаждение этанолом, но с равным успехом можно применять центрифугирование микроколонок.

Материалы:
• ДНК для мечения
• Немеченые нуклеотиды, которые могут поставляться по отдельности (например, фирмой Sigma, UK) или в виде смеси (в наборах для ник-трансляции): для мечения биотином — по 0,2 мМ dCTP, dGTP, dTTP; для мечения дигоксигенином — по 0,2 мМ dCTP, dGTP, dATP
• Меченые нуклеотиды: дигоксигенин-11-dUTP (dig-dUTP, 1мМ; Boehringer Mannheim, Germany) или биотин-7-dATP (bio-dATP, 0,4 мМ; Amersham, UK)
• Смесь dig-dUTP/dTTP (1:2): ее можно приобрести у фирмы Boehringer Mannheim или приготовить самим, смешав 1 мМ растворы dig-dUTP и dTTP в объемном соотношении 1:2
• Ферменты: ДНК-полимераза I (5 ЕД/мкл), ДНКаза I

• Гликоген: 20 мг/мл
• 200 мМ ЭДТА, рН 8,0
• 3 М ацетат натрия, рН 6,0
• Абсолютный этанол
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

1. Смешивают в микроцентрифужной пробирке на 0,5 мл следующие реактивы - биотин и дигоксигенин соответственно:
• Плазмидная ДНК 1 мкг 1 мкг
• Немеченые нуклеотиды 5 мкл 5 мкл
• Смесь dig-dUTP/dTTP — 1 мкл
• Bio-dATP 2,5 мкл —
• ДНКаза 1-5нг 1-5 нг

2. Доводят водой объем реакционной смеси до 49 мкл и инкубируют ее 2 мин при 37 С.
3. Добавляют 1 мкл ДНК полимеразы I (5 ЕД/мкл) и инкубируют 150 мин при 15 С.
4. Добавляют 5 мкл 200 мМ ЭДТА и прогревают реакционную смесь при 75 С 10 мин для остановки реакции.
5. Добавляют 1 мкл гликогена.

6. Добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 6,0, и 2 объема абсолютного этанола.
7. Инкубируют 20 мин в сухом льду или в течение ночи при -20 °С.
8. Центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g 20 мин.
9. Промывают осадок четыре раза 80% этанолом.

10. Осадок высушивают на лиофильной сушке и растворяют в 50 мкл буфера ТЭ.
11. Меченые зонды хранят при —70 С или 4 °С. Если зонды хранятся при -70 °С, их нельзя многократно замораживать и оттаивать.

Синтез, инициируемый рассеянной затравкой. Метод RPDS основан на случайной гибридизации гексамерных олигонуклеотидов с линеаризованной матрицей с последующей ферментативной элонгацией цепи путем присоединения меченых нуклеотидов. Образующийся зонд имеет варьирующую длину, а метку несет не только вставка, но и векторная ДНК. Получаемые таким образом зонды сходны с зондами, сконструированными методом ник-трансляции, но доля фрагментов небольшого размера выше, что может приводить к увеличению фона. Кроме того, перед мечением плазмиду необходимо перевести в линейную форму. Достоинством метода является то, что он позволяет достичь более высокого уровня мечения. По нашему мнению, для обнаружения ДНК лучше использовать зонды, полученные методом ник-трансляции, поскольку они обеспечивают более высокую чувствительность.

- Читать далее "Одноцепочечные ДНК-зонды. Одноцепочечные РНК-зонды"