Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы

Главной задачей современной клеточной биологии является расшифровка деятельности клеток на молекулярном уровне. Эта задача требует использования методик, которые позволяют анализировать молекулы, участвующие в процессе передачи потока информации от ДНК к белку. В основе многих методов лежит гибридизация.

Гибридизация представляет собой связывание двух одиночных нитей нуклеиновых кислот (ДНК с ДНК, РНК с РНК или РНК с ДНК), которые в случае их комплементарности распознают друг друга. Чем больше сходство последовательностей нуклеотидов, тем активнее комплементарные нити образуют «гибридные» двухцепочечные молекулы.

Гибридизация, таким образом, дает возможность специфической идентификации последовательностей ДНК или РНК.

Гибридизация in situ

При непосредственном использовании на клетках и срезах тканей, мазках или хромосомах раздавленных митотических клеток описанный метод называется гибридизацией in situ.

Этот метод идеально подходит для определения наличия в клетке специфической последовательности ДНК (например, гена или его части), для идентификации клеток, в которых осуществляется транскрипция определенного гена, или для выявления локализации гена в определенной хромосоме. ДНК внутри клетки следует первоначально денатурировать нагреванием или денатурирующими агентами для разделения двух нитей ДНК.

метод гибридизации в иммуноцитохимии

После этого они готовы для гибридизации с сегментом одноцепочечной ДНК или РНК, который комплементарен выявляемой последовательности. Такая последовательность известна как зонд. Зонд можно получить клонированием, амплификацией (усилением) изучаемой последовательности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или синтезом, если эта последовательность короткая.

Зонд должен быть маркирован меткой, обычно радиоактивным изотопом (который можно обнаружить с помощью авторадиографии) или модифицированным нуклеотидом (дигоксигенином), который можно идентифицировать иммуноцитохимически.

При гибридизации in situ срезы ткани, культивируемые клетки, мазки или хромосомы раздавленных митотических клеток сначала нагревают для разделения двойных нитей их ДН К. Далее на образец наносят раствор, содержащий зонд, на период времени, необходимый для гибридизации.
После удаления избытка зонда отмыванием по расположению метки определяют локализацию меченого зонда.

Гибридизацию можно также проводить с очищенными ДНК или РНК на плотном носителе. Смеси ДНК или РНК разделяют электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле.

После электрофореза фрагменты нуклеиновых кислот переносят на нейлоновый или нитроцеллюлозный лист: буфер протекает через гель и мембрану за счет капиллярности, перенося молекулы нуклеиновых кислот, которые прочно связываются с нейлоновым или нитроцеллюлозным листом, где можно проводить дальнейший анализ нуклеиновых кислот. Этот метод идентификации ДНК называется Саузерн-блоттингом. Если проводится электрофорез РНК, метод называют нозерн-блоттингом.

Методы гибридизации обладают высокой специфичностью и часто используются в исследованиях, клинической диагностике и судебной медицине.

- Читать далее "Трудности исследования срезов тканей. Причины проблем"

Оглавление темы "Методы гистологии":
  1. Трансмиссионная электронная микроскопия: методика, принципы
  2. Сканирующая электронная микроскопия: методика, принципы
  3. Авторадиография срезов тканей: методика, принципы
  4. Культура клеток и тканей. Применение
  5. Фракционирование клеток. Гистохимия, цитохимия
  6. Полисахариды, олигосахариды и липиды клеток и тканей
  7. Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела
  8. Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы
  9. Трудности исследования срезов тканей. Причины проблем
  10. Разновидности клеток организма. Классификация

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: