Фракционирование клеток. Гистохимия, цитохимия

Органеллы и другие компоненты клеток и тканей можно выделить путем фракционирования клеток. Это — физический процесс, основанный на использовании центробежной силы для разделения органелл и клеточных компонентов в зависимости от их коэффициентов седиментации. Коэффициент седиментации (осаждения) частицы зависит от ее размера, формы и плотности, а также от вязкости среды. Органеллы, полученные этим методом, можно проанализировать на их чистоту, используя электронный микроскоп, а их химический состав и функции можно изучать in vitro.

Термины гистохимия и цитохимия используют для обозначения методов выявления веществ в срезах тканей. Для получения такой информации применяют ряд процедур, большей частью основанных на специфических химических реакциях или на высокоаффинных (с высоким сродством) взаимодействиях между макромолекулами. При использовании этих методов обычно получают нерастворимые окрашенные или электронно-плотные соединения, которые дают возможность обнаружения локализации определенных веществ посредством световой или электронной микроскопии.

Ионы. Ряд ионов (например, кальций, железо, фосфаты) выявляют в тканях с помощью этих методов при использовании химических реакций, дающих темный нерастворимый продукт.

Нуклеиновые кислоты. ДНК можно идентифицировать и оценить количественно в ядрах клеток с помощью реакции Фельгена, которая окрашивает ДНК в красный цвет. Определение ДНК и РНК можно также провести путем окрашивания клеток или срезов тканей основным красителем.

Белки. Хотя существуют общие методики выявления белков в срезах тканей, гистохимические методы обычно не позволяют идентифицировать конкретные белки в клетках и тканях. Этого результата позволяет достичь иммуноцитохимия, которая представлена в этой главе далее.

гистохимия клеток и тканей

Ряд гистохимических методов можно использовать для того, чтобы выявить более или менее специфические ферменты, которые представляют собой большую группу белков. Эти методы (называемые гистоэнзимологическими) обычно основаны на способности ферментов воздействовать на специфические химические связи. Использование большинства гистоэнзимологических методов включает следующие этапы:
1) срезы ткани погружают в раствор, содержащий субстрат изучаемого фермента;
2) фермент воздействует на свой субстрат;
3) на этой или последующей стадии происходит взаимодействие среза с маркерным соединением;
4) это соединение реагирует с молекулой, которая получается в результате расщепления или изменения субстрата;
5) конечный продукт реакции, который должен быть нерастворимым и видным при использовании световой или электронной микроскопии, осаждается над участками, содержащими фермент. При изучении такого среза под микроскопом можно увидеть клетки (или органеллы), покрытые окрашенным или электронно-плотным материалом.

Ниже приведены примеры ферментов, которые можно выявить гистохимическими методами.

Фосфатазы — это ферменты, широко распространенные в организме. Они расщепляют связь между фосфатными группами и спиртовым остатком в фосфорилированных молекулах. Окрашенным нерастворимым продуктом реакции выявления фосфатаз обычно служит фосфат свинца или сульфид свинца. На срезах можно выявить щелочные фосфатазы, максимальная активность которых соответствует щелочным значениям рН. Кислую фосфатазу часто выявляют, поскольку она маркирует лизосомы — органеллы цитоплазмы, содержащие этот фермент.

Дегидрогеназы переносят водород с одного субстрата на другой. В организме существует много дегидрогеназ, которые играют важную роль в ряде обменных процессов. Дегидрогеназы выявляют гистохимически путем инкубации срезов нефиксированной ткани в растворе субстрата, содержащем молекулу, которая воспринимает водород и выпадает в осадок в виде нерастворимого окрашенного соединения. Этим методом в митохондриях можно выявить сукцинатдегидрогеназу — ключевой фермент цикла лимонной кислоты (цикла Кребса).

Пероксидаза, которая присутствует в клетках нескольких типов, — фермент, обеспечивающий окисление некоторых субстратов с переносом водородных ионов на перекись кислорода и образованием молекул воды. Для выявления пероксидазы срезы адекватно фиксированной ткани инкубируют в растворе, содержащем перекись водорода и 3,3'-диаминоазобензидин.

Последнее соединение окисляется в присутствии пероксидазы, давая нерастворимый, коричневый, электронно-плотный осадок, который дает возможность локализовать активность пероксиды на уровне световой и электронной микроскопии. Этим методом выявляют активность пероксидазы в клетках крови, которая имеет большое значение в диагностике лейкозов.

Поскольку пероксидаза чрезвычайно активна и за короткое время образует значительное количество нерастворимого осадка, она получила широкое распространение для практических целей — маркировки других соединений. Молекулы пероксидазы очищают, изолируют и связывают с другой молекулой.

- Читать далее "Полисахариды, олигосахариды и липиды клеток и тканей"

Оглавление темы "Методы гистологии":
  1. Трансмиссионная электронная микроскопия: методика, принципы
  2. Сканирующая электронная микроскопия: методика, принципы
  3. Авторадиография срезов тканей: методика, принципы
  4. Культура клеток и тканей. Применение
  5. Фракционирование клеток. Гистохимия, цитохимия
  6. Полисахариды, олигосахариды и липиды клеток и тканей
  7. Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела
  8. Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы
  9. Трудности исследования срезов тканей. Причины проблем
  10. Разновидности клеток организма. Классификация

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: