Молекулу, находящуюся в срезе ткани, можно идентифицировать, используя соединения, которые специфически взаимодействуют с этой молекулой. Соединения, которые будут взаимодействовать с молекулой, должны быть маркированы меткой, которую можно будет выявить при использовании светового или электронного микроскопа.

Наиболее часто используемые метки — это флюоресцирующие соединения (которые можно увидеть с помощью флюоресцентного или лазерного микроскопа), радиоактивные атомы (которые можно выявить методом авторадиографии), молекулы пероксидазы (которые можно обнаружить путем выявления фермента с использованием переклей водорода и 3,3'-диаминоазобензидина) или другие ферменты (которые можно выявить с помощью соответствующих субстратов), а также металлические (обычно золотые) частицы, которые можно наблюдать с помощью световой и электронной микроскопии. Эти методы используют главным образом для выявления углеводов, белков и нуклеиновых кислот.

Фаллоидин, белок А, лектины и антитела служат примерами соединений, которые специфически взаимодействуют с другими молекулами.
Фаллоидин, получаемый из гриба (Amanita phalloides), сильно взаимодействует с актином, его обычно маркируют флюоресцирующими красителями для выявления актиновых филаментов.

Белок А — белок, получаемый из Staphylococcus aureus, который связывается с Fc-областью молекул иммуноглобулинов (антител). Меченый белок А может быть использован для выявления иммуноглобулинов.

Лектины — белки или гликопротеины, получаемые главным образом из семян растений, которые связываются с высоким сродством и специфичностью с углеводами. Различные лектины взаимодействуют со специфическими последовательностями молекул Сахаров. Они способны связываться с гликопротеинами, протеогликанами и гликолипидами и широко используются для характеристики мембранных молекул, содержащих определенные последовательности углеводов.

Ряд гистохимических методов часто используют в лабораторной диагностике заболеваний, которые приводят к накоплению железа, гликогена, гликозаминогликанов и других веществ. Примерами могут служить реакция Перлса на железо (например, при гемохроматозе и гемосидерозе), ШИК-реакция с амилазой на гликоген (при гликогенозе), окраска альциановым синим на гликозаминогликаны (при мукополисахаридозе) и окраска липидов (при сфинголипидозе).

Взаимодействие антигена со своим антителом — пример высокоспецифического взаимодействия между молекулами. По этой причине методы с использованием меченых антител оказались наиболее полезными для идентификации и локализации специфических белков и гликопротеинов.

В организме имеются клетки, которые способны отличать свои собственные молекулы (свое) от чужеродных. В ответ на воздействие чужеродных молекул, известных как антигены, организм вырабатывает белки — антитела, — которые специфически реагируют с антигеном и связывают его, тем самым способствуя удалению чужеродного вещества. Антитела — белки, относящиеся к семейству, включающему многочисленные иммуноглобулины.

В иммуноцитохимических исследованиях срезы ткани (или клетки в культуре), которые могут содержать определенные белки, инкубируют в растворе, содержащем антитела к этому белку. Антитела специфически связываются с белком, локализацию которого можно проследить с помощью светового или электронного микроскопа, в зависимости от типа соединения, используемого для маркировки антител.

Одно из наиболее важных требований к иммуноцитохимическим методам — наличие антител к выявляемому белку. Это означает необходимость предварительной очистки и выделения данного белка с тем, чтобы можно было получить антитела.

Поликлональные и моноклональные антитела

Предположим, что нашей задачей является получение антител к белку х определе иного вида животного (например, крысы) или человека. В том случае, когда белок х уже выделен, его вводят животному другого вида (например, кролику или козе).

Если белок отличается настолько, что данное животное распознает его как чужеродный, т.е. как антиген, у животного будут вырабатываться антитела к этому белку (например, кроличьи антитела к белку х крысы или козьи антитела к белку х человека). Эти антитела получают из плазмы животного и используют в иммуноцитохимии.

Несколько групп (клонов) лимфоцитов животного, которому ввели белок х, могут распознавать различные участки молекулы белка, причем каждая группа вырабатывает антитела к соответствующему участку. Такие поликлональные антитела являются смесью антител.

Возможно, однако, воздействовать белком х налимфоциты, находящиеся в культуре клеток (в действительности, на лимфоциты, объединенные с опухолевыми клетками). Отдельные клоны лимфоцитов будут вырабатывать различные антитела к нескольким участкам молекулы белках. Можно выделить каждый клон и культивировать его самостоятельно — таким образом, чтобы различные антитела к белку х можно было получать по отдельности.

Полученные таким путем антитела — это моноклональные антитела. Существует ряд преимуществ использования моноклональных антител по сравнению с поликлональными: например, можно отобрать моноклональные антитела по высокой специфичности и по активности связывания с выявляемым белком. Поэтому будет меньше неспецифического связывания с другими белками, сходными с изучаемым.

Прямой иммуноцитохимический метод основан на использовании антител (моноклональных или поликлональных), которые должны быть маркированы соответствующей меткой. Срез ткани инкубируют с антителами в течение некоторого времени с тем, чтобы произошло взаимодействие и связывание антител с белком х.

Срез далее промывают для удаления несвязанных антител. В зависимости от использованной метки (флюоресцирующее соединение, фермент, частицы золота) срез можно исследовать с помощью светового или электронного микроскопа.

Если в качестве метки использована пероксидаза или другой фермент, до изучения среза ткани под микроскопом следует выявить этот фермент. Участки среза ткани, содержащие белокх, будут флюоресцировать, окажутся покрытыми частицами золота или темным осадком, если маркером служил фермент.

Непрямой иммуноцитохимический метод обладает более высокой чувствительностью, но требует большего числа этапов. Предположим, что наша цель заключается в выявлении белках, имеющегося у крыс. Прежде, чем проводить иммуноцитохимическую реакцию, следует выполнить две процедуры:
(1) сначала необходимо получить антитела (поликлональные или моноклональные) к белку х крысы у животного другого вида (например, кролика);
(2) параллельно иммуноглобулин нормального (не получавшего инъекции) кролика вводят животному третьего вида (например, козе).

Кроличьи иммуноглобулины являются чужеродными для козы и поэтому способны вызывать у этого животного выработку антител (антител к антителам, или антииммуноглобулинов).

Непрямое иммуноцитотохимическое выявление первоначально включает инкубацию среза ткани крысы, содержащего белок х, с кроличьими антителами к белку х. После промывания срезы ткани инкубируют с мечеными козьими антителами к кроличьим антителам. Эти антитела к антителам будут связываться с кроличьими антителами, которые уже ранее связались с белком х.

Белок х далее можно обнаружить с использованием микроскопического метода, соответствующего метке, маркирующей вторичные антитела. Существуют другие непрямые методы с использованием иных промежуточных молекул, такие, как методика с биотином-авидином.

- Читать далее "Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы"

1. Трансмиссионная электронная микроскопия: методика, принципы
2. Сканирующая электронная микроскопия: методика, принципы
3. Авторадиография срезов тканей: методика, принципы
4. Культура клеток и тканей. Применение
5. Фракционирование клеток. Гистохимия, цитохимия
6. Полисахариды, олигосахариды и липиды клеток и тканей
7. Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела
8. Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы
9. Трудности исследования срезов тканей. Причины проблем
10. Разновидности клеток организма. Классификация