Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела

Взаимодействие антигена со своим антителом — пример высокоспецифического взаимодействия между молекулами. По этой причине методы с использованием меченых антител оказались наиболее полезными для идентификации и локализации специфических белков и гликопротеинов.

В организме имеются клетки, которые способны отличать свои собственные молекулы (свое) от чужеродных. В ответ на воздействие чужеродных молекул, известных как антигены, организм вырабатывает белки — антитела, — которые специфически реагируют с антигеном и связывают его, тем самым способствуя удалению чужеродного вещества. Антитела — белки, относящиеся к семейству, включающему многочисленные иммуноглобулины.

В иммуноцитохимических исследованиях срезы ткани (или клетки в культуре), которые могут содержать определенные белки, инкубируют в растворе, содержащем антитела к этому белку. Антитела специфически связываются с белком, локализацию которого можно проследить с помощью светового или электронного микроскопа, в зависимости от типа соединения, используемого для маркировки антител.

Одно из наиболее важных требований к иммуноцитохимическим методам — наличие антител к выявляемому белку. Это означает необходимость предварительной очистки и выделения данного белка с тем, чтобы можно было получить антитела.

Поликлональные и моноклональные антитела

Предположим, что нашей задачей является получение антител к белку х определе иного вида животного (например, крысы) или человека. В том случае, когда белок х уже выделен, его вводят животному другого вида (например, кролику или козе).

Если белок отличается настолько, что данное животное распознает его как чужеродный, т.е. как антиген, у животного будут вырабатываться антитела к этому белку (например, кроличьи антитела к белку х крысы или козьи антитела к белку х человека). Эти антитела получают из плазмы животного и используют в иммуноцитохимии.

Несколько групп (клонов) лимфоцитов животного, которому ввели белок х, могут распознавать различные участки молекулы белка, причем каждая группа вырабатывает антитела к соответствующему участку. Такие поликлональные антитела являются смесью антител.

иммуноцитохимия

Возможно, однако, воздействовать белком х налимфоциты, находящиеся в культуре клеток (в действительности, на лимфоциты, объединенные с опухолевыми клетками). Отдельные клоны лимфоцитов будут вырабатывать различные антитела к нескольким участкам молекулы белках. Можно выделить каждый клон и культивировать его самостоятельно — таким образом, чтобы различные антитела к белку х можно было получать по отдельности.

Полученные таким путем антитела — это моноклональные антитела. Существует ряд преимуществ использования моноклональных антител по сравнению с поликлональными: например, можно отобрать моноклональные антитела по высокой специфичности и по активности связывания с выявляемым белком. Поэтому будет меньше неспецифического связывания с другими белками, сходными с изучаемым.

Прямой иммуноцитохимический метод основан на использовании антител (моноклональных или поликлональных), которые должны быть маркированы соответствующей меткой. Срез ткани инкубируют с антителами в течение некоторого времени с тем, чтобы произошло взаимодействие и связывание антител с белком х.

Срез далее промывают для удаления несвязанных антител. В зависимости от использованной метки (флюоресцирующее соединение, фермент, частицы золота) срез можно исследовать с помощью светового или электронного микроскопа.

Если в качестве метки использована пероксидаза или другой фермент, до изучения среза ткани под микроскопом следует выявить этот фермент. Участки среза ткани, содержащие белокх, будут флюоресцировать, окажутся покрытыми частицами золота или темным осадком, если маркером служил фермент.

Непрямой иммуноцитохимический метод обладает более высокой чувствительностью, но требует большего числа этапов. Предположим, что наша цель заключается в выявлении белках, имеющегося у крыс. Прежде, чем проводить иммуноцитохимическую реакцию, следует выполнить две процедуры:
(1) сначала необходимо получить антитела (поликлональные или моноклональные) к белку х крысы у животного другого вида (например, кролика);
(2) параллельно иммуноглобулин нормального (не получавшего инъекции) кролика вводят животному третьего вида (например, козе).

Кроличьи иммуноглобулины являются чужеродными для козы и поэтому способны вызывать у этого животного выработку антител (антител к антителам, или антииммуноглобулинов).

Непрямое иммуноцитотохимическое выявление первоначально включает инкубацию среза ткани крысы, содержащего белок х, с кроличьими антителами к белку х. После промывания срезы ткани инкубируют с мечеными козьими антителами к кроличьим антителам. Эти антитела к антителам будут связываться с кроличьими антителами, которые уже ранее связались с белком х.

Белок х далее можно обнаружить с использованием микроскопического метода, соответствующего метке, маркирующей вторичные антитела. Существуют другие непрямые методы с использованием иных промежуточных молекул, такие, как методика с биотином-авидином.

- Читать далее "Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы"

Оглавление темы "Методы гистологии":
  1. Трансмиссионная электронная микроскопия: методика, принципы
  2. Сканирующая электронная микроскопия: методика, принципы
  3. Авторадиография срезов тканей: методика, принципы
  4. Культура клеток и тканей. Применение
  5. Фракционирование клеток. Гистохимия, цитохимия
  6. Полисахариды, олигосахариды и липиды клеток и тканей
  7. Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела
  8. Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы
  9. Трудности исследования срезов тканей. Причины проблем
  10. Разновидности клеток организма. Классификация

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: