Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела

Молекулу, находящуюся в срезе ткани, можно идентифицировать, используя соединения, которые специфически взаимодействуют с этой молекулой. Соединения, которые будут взаимодействовать с молекулой, должны быть маркированы меткой, которую можно будет выявить при использовании светового или электронного микроскопа.

Наиболее часто используемые метки — это флюоресцирующие соединения (которые можно увидеть с помощью флюоресцентного или лазерного микроскопа), радиоактивные атомы (которые можно выявить методом авторадиографии), молекулы пероксидазы (которые можно обнаружить путем выявления фермента с использованием переклей водорода и 3,3'-диаминоазобензидина) или другие ферменты (которые можно выявить с помощью соответствующих субстратов), а также металлические (обычно золотые) частицы, которые можно наблюдать с помощью световой и электронной микроскопии. Эти методы используют главным образом для выявления углеводов, белков и нуклеиновых кислот.

Фаллоидин, белок А, лектины и антитела служат примерами соединений, которые специфически взаимодействуют с другими молекулами.
Фаллоидин, получаемый из гриба (Amanita phalloides), сильно взаимодействует с актином, его обычно маркируют флюоресцирующими красителями для выявления актиновых филаментов.

Белок А — белок, получаемый из Staphylococcus aureus, который связывается с Fc-областью молекул иммуноглобулинов (антител). Меченый белок А может быть использован для выявления иммуноглобулинов.

Лектины — белки или гликопротеины, получаемые главным образом из семян растений, которые связываются с высоким сродством и специфичностью с углеводами. Различные лектины взаимодействуют со специфическими последовательностями молекул Сахаров. Они способны связываться с гликопротеинами, протеогликанами и гликолипидами и широко используются для характеристики мембранных молекул, содержащих определенные последовательности углеводов.

Ряд гистохимических методов часто используют в лабораторной диагностике заболеваний, которые приводят к накоплению железа, гликогена, гликозаминогликанов и других веществ. Примерами могут служить реакция Перлса на железо (например, при гемохроматозе и гемосидерозе), ШИК-реакция с амилазой на гликоген (при гликогенозе), окраска альциановым синим на гликозаминогликаны (при мукополисахаридозе) и окраска липидов (при сфинголипидозе).

Взаимодействие антигена со своим антителом — пример высокоспецифического взаимодействия между молекулами. По этой причине методы с использованием меченых антител оказались наиболее полезными для идентификации и локализации специфических белков и гликопротеинов.

В организме имеются клетки, которые способны отличать свои собственные молекулы (свое) от чужеродных. В ответ на воздействие чужеродных молекул, известных как антигены, организм вырабатывает белки — антитела, — которые специфически реагируют с антигеном и связывают его, тем самым способствуя удалению чужеродного вещества. Антитела — белки, относящиеся к семейству, включающему многочисленные иммуноглобулины.

В иммуноцитохимических исследованиях срезы ткани (или клетки в культуре), которые могут содержать определенные белки, инкубируют в растворе, содержащем антитела к этому белку. Антитела специфически связываются с белком, локализацию которого можно проследить с помощью светового или электронного микроскопа, в зависимости от типа соединения, используемого для маркировки антител.

Одно из наиболее важных требований к иммуноцитохимическим методам — наличие антител к выявляемому белку. Это означает необходимость предварительной очистки и выделения данного белка с тем, чтобы можно было получить антитела.

Поликлональные и моноклональные антитела

Предположим, что нашей задачей является получение антител к белку х определе иного вида животного (например, крысы) или человека. В том случае, когда белок х уже выделен, его вводят животному другого вида (например, кролику или козе).

Если белок отличается настолько, что данное животное распознает его как чужеродный, т.е. как антиген, у животного будут вырабатываться антитела к этому белку (например, кроличьи антитела к белку х крысы или козьи антитела к белку х человека). Эти антитела получают из плазмы животного и используют в иммуноцитохимии.

Несколько групп (клонов) лимфоцитов животного, которому ввели белок х, могут распознавать различные участки молекулы белка, причем каждая группа вырабатывает антитела к соответствующему участку. Такие поликлональные антитела являются смесью антител.

иммуноцитохимия
Соединения, обладающие сродством к другим молекулам, можно маркировать с помощью метки и использовать для идентификации этих молекул.
Молекула А обладает высоким и специфическим сродством к части молекулы Б (1).
При смешивании молекул А и Б молекула А связывается с участком на молекуле Б, который она распознает (2).
Молекулу А можно маркировать с помощью метки, которую можно выявить при использовании светового или электронного микроскопа.
Меткой может быть флюоресцирующее соединение, фермент (например, пероксидаза), частицы золота или радиоактивный атом (3).
Если молекула Б содержится в клетке или межклеточном веществе, которые инкубируются с меченой молекулой А, молекулу Б можно будет обнаружить (4).
иммуноцитохимия
Ультрацентрифугирование (А) и хроматография (Б): методы выделения белков.
А — смесь белков, полученную из гомогенизированных клеток или тканей, центрифугируют с высокой скоростью в течение нескольких часов.
Белки разделяются нанесколько фракций (полос) в зависимости от размера и плотности белковой молекулы.
Среду, в которой проводили ультрацентрифугированис, собирают в виде нескольких фракций, содержащих различные белки, которые можно подвергнуть дальнейшему анализу.
Б — раствор, содержащий смесь белков, полученных при гомогенизации клеток или тканей, вносят в колонну, заполненную частицами с различными химическими свойствами.
Например, частицы могут иметь различные электростатические заряды (привлекая белки в соответствии с их зарядом) или различные размеры пор (которые играют роль сита для молекул различного размера).
По мере перемещения белков по колонне их движение замедляется в соответствии с их взаимодействиями с частицами. Из оттекающей среды можно выделить различные группы белков.
иммуноцитохимия
Гель-электрофорез: метод выделения белков.
А — выделение белков. Смеси белков получают из гомогенизированных клеток или тканей. Их обычно обрабатывают сильным детергентом (додецилсульфатом натрия) и меркаптоэтанолом для разворачивания и разделения субъединиц белка (1).
Образцы помещают на пластины полиакриламидного геля, которые подвергают воздействию электрического поля. Белки мигрируют по гелю в соответствии с их размером и формой (2).
К гелю добавляют смесь белков с известной молекулярной массой в качестве эталона для идентификации молекулярной массы других белков (3).
Б — выявление и идентификация белков. Окрашивание. Все белки окрашиваются в один цвет. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации белка (1).
Авторадиография. Радиоактивные белки можно обнаружить с помощью авторадиографии. Рентгеновскую пленку на определенное время прикладывают к гелю, после чего проявляют.
Радиоактивные белки будут иметь вид темных полос на пленке (2).
Иммуноблоттинг. Белки можно перенести с геля на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубируют с мечеными антителами к белкам, присутствующим в образце (3).
иммуноцитохимия

Возможно, однако, воздействовать белком х налимфоциты, находящиеся в культуре клеток (в действительности, на лимфоциты, объединенные с опухолевыми клетками). Отдельные клоны лимфоцитов будут вырабатывать различные антитела к нескольким участкам молекулы белках. Можно выделить каждый клон и культивировать его самостоятельно — таким образом, чтобы различные антитела к белку х можно было получать по отдельности.

Полученные таким путем антитела — это моноклональные антитела. Существует ряд преимуществ использования моноклональных антител по сравнению с поликлональными: например, можно отобрать моноклональные антитела по высокой специфичности и по активности связывания с выявляемым белком. Поэтому будет меньше неспецифического связывания с другими белками, сходными с изучаемым.

Прямой иммуноцитохимический метод основан на использовании антител (моноклональных или поликлональных), которые должны быть маркированы соответствующей меткой. Срез ткани инкубируют с антителами в течение некоторого времени с тем, чтобы произошло взаимодействие и связывание антител с белком х.

Срез далее промывают для удаления несвязанных антител. В зависимости от использованной метки (флюоресцирующее соединение, фермент, частицы золота) срез можно исследовать с помощью светового или электронного микроскопа.

Если в качестве метки использована пероксидаза или другой фермент, до изучения среза ткани под микроскопом следует выявить этот фермент. Участки среза ткани, содержащие белокх, будут флюоресцировать, окажутся покрытыми частицами золота или темным осадком, если маркером служил фермент.

Непрямой иммуноцитохимический метод обладает более высокой чувствительностью, но требует большего числа этапов. Предположим, что наша цель заключается в выявлении белках, имеющегося у крыс. Прежде, чем проводить иммуноцитохимическую реакцию, следует выполнить две процедуры:
(1) сначала необходимо получить антитела (поликлональные или моноклональные) к белку х крысы у животного другого вида (например, кролика);
(2) параллельно иммуноглобулин нормального (не получавшего инъекции) кролика вводят животному третьего вида (например, козе).

Кроличьи иммуноглобулины являются чужеродными для козы и поэтому способны вызывать у этого животного выработку антител (антител к антителам, или антииммуноглобулинов).

Непрямое иммуноцитотохимическое выявление первоначально включает инкубацию среза ткани крысы, содержащего белок х, с кроличьими антителами к белку х. После промывания срезы ткани инкубируют с мечеными козьими антителами к кроличьим антителам. Эти антитела к антителам будут связываться с кроличьими антителами, которые уже ранее связались с белком х.

Белок х далее можно обнаружить с использованием микроскопического метода, соответствующего метке, маркирующей вторичные антитела. Существуют другие непрямые методы с использованием иных промежуточных молекул, такие, как методика с биотином-авидином.

иммуноцитохимия
Прямой иммуноцитохимический метод. Молекула иммуноглобулина (Ig) (1).
Выработка поликлональных антител. Белок х крысы вводят кролику. Вырабатываются несколько кроличьих Ig к белку х (2).
Маркировка антител. Кроличьи Ig маркируются меткой (3).
Иммунонитохимическая реакция. Кроличьи Ig распознают белок х и связываются с его различными частями (4).
иммуноцитохимия
Непрямой иммуноцитохимический метод. Выработка первичных поликлональных антител. Белок х крысы вводят кролику. На белок х вырабатываются несколько кроличьих иммуноглобулинов (Ig) (1).
Выработка вторичных антител. Ig неиммунного (нормального) кролика вводят козе. Вырабатываются козьи Ig к кроличьим Ig. Далее выделяют козьи Ig и маркируют меткой (2).
Первый этап иммуноцитохимической реакции. Кроличьи Ig распознают различные участки белка х и связываются с ними (3).
Второй этап иммуноцитохимической реакции. Меченые козьи Ig распознают различные участки молекулы кроличьих иммуноглобулинов и связываются с ними, тем самым маркируя белок х (4).
иммуноцитохимия
Децидуальная клетка мыши, выращенная in vitro.
Белок десмин, образующий промежуточные филаменты, выявлен с помощью непрямого иммунофлюоресцентного метода.
Сеть флюоресцирующих промежуточных филаменгов занимает большую часть цитоплазмы.
Ядро (Я) окрашено в синий цвет. Большое увеличение.
иммуноцитохимия
Тонкая кишка. Срез обработан антителами к ферменту лизоциму для выявления лизосом в макрофагах и клетках Панета.
Коричневое окрашивание, указывающее на присутствие лизоцима, возникает вследствие реакции выявления пероксидазы, которая связана со вторичными антителами.
Ядра докрашены гематоксилином. Среднее увеличение.
иммуноцитохимия
Аденокарцинома толстой кишки. Иммуноцитохимическое выявление раково-эмбрионального антигена.
Раково-эмбриональный антиген представляет собой белок, присутствующий в некоторых злокачественных опухолях, главным образом молочной железы и кишечника.
Антитела помечены пероксидазой; коричневый осадок указывает на опухолевые клетки. Докраска гематоксилином. Среднее увеличение.
иммуноцитохимия
Ацинарная клетка поджелудочной железы. Срез инкубировали с антителами к амилазе и окрашивали белком А, связанным с частицами золота.
Белок А обладает высоким сродством к молекулам антител. Частицы золота имеют вид очень мелких черных точек, расположенных над секреторными гранулами.
Электронная микрофотография.

- Читать далее "Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы"

Оглавление темы "Методы гистологии":
  1. Трансмиссионная электронная микроскопия: методика, принципы
  2. Сканирующая электронная микроскопия: методика, принципы
  3. Авторадиография срезов тканей: методика, принципы
  4. Культура клеток и тканей. Применение
  5. Фракционирование клеток. Гистохимия, цитохимия
  6. Полисахариды, олигосахариды и липиды клеток и тканей
  7. Иммуноцитохимия: поликлональные и моноклональные антитела
  8. Метод гибридизации в иммуноцитохимии: методика, принципы
  9. Трудности исследования срезов тканей. Причины проблем
  10. Разновидности клеток организма. Классификация

Ваши замечания и вопросы: