Пренатальная диагностика гемоглобинопатий у плода при беременности

Пренатальная диагностика гемоглобинопатий у плода при беременности

При всех перечисленных выше гемоглобинопатиях генные дефекты можно считать рецессивными в том смысле, что у гетерозиготных индивидуумов половина генов (один из пары или два из двух пар) для данной глобиновой цепи функционирует, образуя нормальные белковые молекулы, а функция другой половины генов приводит к синтезу измененных молекул.

Индивидуумы с гемоглобинопатией либо гомозиготны, либо являются двойными гетерозиготами по измененному гену (или генам). До недавнего времени акушеры мало что могли предложить носителям а- и b-талассемии, так же как носителям гена структурно измененного гемоглобина. Беременность у таких женщин протекает без осложнений, и роль акушеров ограничивалась генетической консультацией и выполнением аборта, если супруги очень боялись родить больного ребенка.

Усовершенствование методов внутриутробной диагностики гемоглобинопатии в настоящее время позволяет дать родителям определенный ответ, а не ограничиваться статистической вероятностью. При наличии риска супружеские пары теперь могут избежать рождения больного ребенка, не оставаясь бездетными и не пребывая месяцами в страхе в ожидании исхода беременности.

Ввиду безусловной летальности гомозиготного состояния по а-талассемии при последней не стоят те основные медицинские и социальные проблемы, которые связаны с b-талассемией. Но и в этом случае желательна ранняя диагностика, чтобы свести до минимума эмоциональную травму, обусловленную безуспешной беременностью, и предотвратить развитие преэклампсии в III триместре, столь частой при а-талассемии [Eng et al.].

Пренатальная диагностика а-талассемии заключается в определении числа интактных структурных генов а-глобина в клеточном геноме методом молекулярной гибридизации [Kan et al.]. Поскольку любая ядросодержащая клетка, в том числе фибробласты амниотической жидкости, содержит полный набор глобиновых генов, путем амниоцентеза получают клетки плода, которые затем можно культивировать и исследовать.

Используя обратную транскряптазу — вирусный фермент, который транскрибирует ДНК с РНК, — путем транскрипции с иРНК для «-глобина получают комплементарную а-ДНК (кДНК). Эта кДНК комплементарна также клеточным структурным генам для а-глобина и может связываться с последними. Скорость связывания кДНК с ДНК амниотических фибробластов пропорциональна числу копий структурных генов а-глобина в клетках. С помощью такого метода удается четко дифференцировать гомозиготность от гетерозиготного состояния и от нормы. Теперь появился еще один метод диагностики а-талассемии, основанный на использовании рестрикционных эндонуклеаз. О нем пойдет речь в связи с серповидноклеточной анемией.

Для пренатальной диагностики b-талассемии или изменения структуры гемоглобина взрослых (например, серповидно-клеточной анемии), необходимо, чтобы к концу I — началу II триместра внутриутробного развития плод нормально продуцировал НbА. В 60-х годах ряд исследователей обнаружили в начале II триместра гемоглобин, отличающийся от HbF [Walker, Turnbull, Thomas et al.]. В 1972 г. Pataryas и Stamatoyannopoulos с помощью пептидных карт подтвердили, что НbА впервые появляется на 11-й неделе внутриутробного развития.

Они также обнаружили патологические гемоглобины взрослых — НbС и HbS — в начале II триместра. В нескольких лабораториях предприняли изучение начала и типа синтеза гемоглобина на ранних стадиях внутриутробного развития путем определения включения радиоактивных аминокислот в гемоглобин или глобиновые цепи, и теперь этим методом широко пользуются при подобных исследованиях. Типирование гемоглобина плода быстрее осуществляется исследованием синтеза, а не содержания, и для него необходимо всего 10 мкл (0,01 см3) крови плода [Kan et al.].

Чтобы пренатально диагностировать любую гемоглобинопатию, кроме а-талассемии, необходимо получить эритроциты плода, пригодные для изучения синтеза. Кровь плода можно взять под контролем зрения с помощью модифицированной канюли размером 2,2x2,7 мм, через которую вводится и фетоскоп и игла 27-го калибра для взятия крови [Hobbins, Mahoney]. Таким методом в 90% случаев удается получить клетки крови плода в количестве, достаточном для исследования синтеза гемоглобина.

Другой метод взятия крови плода — направляемая сонографически аспирация плаценты через иглу 20-го калибра [Golbus et al.]. Эта методика тоже позволяет получить необходимую пробу в 90% случаев. Вследствие недостатка данных оценить степень безопасности забора крови плода тем и другим методом пока невозможно. Обе методики должны выполняться опытным оператором, и прежде, чем накоплен опыт путем исследования беременностей, подлежащих элективному прерыванию во II триместре, делать попытки пренатальной диагностики недопустимо. Согласно единому мнению, вне зависимости от избираемой методики кровь плода следует брать после 18-й недели внутриутробного развития, поскольку с увеличением срока беременности данное количество взятой крови составляет все меньшую долю от общего объема крови плода.

Какой бы из названных выше методов получения клеток плода ни был применен, он дает смесь крови матери и плода. Поскольку эритроциты плода отличаются от эритроцитов взрослого человека большим объемом, присутствие клеток плода подтверждается с помощью анализатора системы «Coulter», определяющего размер частиц [Kazazian et al.]. Присутствие материнских клеток не является непреодолимой проблемой, поскольку общая скорость синтеза глобина клетками плода в I триместре внутриутробного развития в 500 раз и более превышает скорость этого процесса в материнских клетках [Nathan et al.].

Таким образом, хотя на долю b-цепей приходится 50% синтезируемого глобина в материнских клетках и только 5% — в клетках плода, клетки матери не вносят существенного вклада в общую радиоактивность ||3-цепей. Если в аспирированной крови сравнительно мало клеток плода (по нашим критериям, менее 50%), их можно выделить из смеси с помощью дифференциальной агглютинации антителами к антигену i. Поскольку этот антиген содержат только клетки плода, после концентрации дифференциальной агглютинацией в, аспирате будет 75—100% клеток плода, причем не произойдет избирательной потери клеток, содержащих HbA [Kan et al.]. Умеренная потеря клеток плода, связанная с подобной процедурой, вполне компенсируется обогащением.

К настоящему времени попытка пренатального диагноза предпринята в более чем 500 случаях высокого риска гемоглобинопатии у плода. Накопленный в мире опыт продемонстрировал 2 серьезных осложнения. В одном центре 4 из 9 беременностей, исследованных с помощью плацентарной аспирации, и 3 из 13, при которых пробу брали с помощью фетоскопии, закончились спонтанными выкидышами. При выполнении указанных процедур опытными специалистами частота спонтанного выкидыша теперь составляет примерно 5% [Alter et al., Kan et al.]. Мы относим неблагоприятный исход, отмеченный выше, за счет неопытности оператора.

Другая трудность — ошибки пренатального прогноза. В одном учреждении диагноз гомозиготности плода b-талассемии не подтвердился; когда плод был исследован повторно после прерывания беременности, он оказался гетерозиготным [Alter et al.]. Второй плод, у которого предполагалось наличие признака серповидно-клеточности, после родов оказался больным серповидно-клеточной анемией. Эти ошибки имели место, когда только начали заниматься пренатальной диагностикой гемоглобинопатии, а при придирчивом внимании к деталям и с накоплением опыта подобных ошибок можно избежать.

Перспективы пренатальной диагностики гемоглобинопатий

Пренатальная диагностика гемоглобинопатии — это свершившийся факт. Однако трудность получения эритроцитов плода свидетельствует о том, что методика, требующая только фибробласты плода, нашла бы более широкое применение в клинической практике. В ДНК каждой клетки плода представлен весь геном. Различные дифференцированные и недифференцированные клетки организма отличаются друг от друга порцией ДНК, избирательно дерепрессированной на фоне целиком репрессированного генома [Frenster, Herstein]. Проблема состоит в том, чтобы активировать неэкспрессируемые гены в фибробластах плода, полученных путем амниоцентеза.

Самый реальный на сегодняшний день метод заключается в слиянии фибробластов плода с «активатороными» эритроцитарными клеточными линиями. Гибридизация соматических клеток млекопитающих теперь вполне осуществима. Однако когда линию дифференцированных клеток, обладающих специализированной функцией, скажем, синтезирующих гемоглобин, сливают с недифференцированными клетками, специализированная функция, как правило, гасится. Применительно к пренатальному диагнозу этот метод должен быть модифицирован таким образом, чтобы в недифференцированных клетках амниотической жидкости экспрессировался синтез гемоглобина.

Принципиальная возможность решения подобной задачи продемонстрирована получением мышиного альбумина из фибробластов мыши, слитых с клетками гепатомы крысы [Petersen, Weiss]. Ген, детерминирующий синтез альбумина, в норме «включен» только в печеночных клетках, но дерепрессируется в мышиных фибробластах клетками гепатомы.

Другая возможность использовать фибробласты плода для пренатальной диагностики гемоглобинопатии состоит в применении рестрикционных эндонуклеаз — ферментов, которые расщепляют ДНК в определенных точках, определяемых последовательностью нуклеотидов. Действие рестрикционных эндонуклеаз все расширяется, и каждая из них специфична по отношению к определенной короткой последовательности нуклеотидов в ДНК. Образовавшиеся в результате действия эндонуклеаз фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле, а число и тип фраментов позволяют картировать геном.

Orkin и сотр. применили эту методику для верификации делеции b-глобиновой последовательности в случаях гомозиготной b-талассемии и наследственном сохранении фетального гемоглобина. Теоретически при наличии рестрикционной эндонуклеазы, обладающей необходимой специфичностью, таким методом можно выявить и любую точечную мутацию. Например, глобин bs синтезируется в результате замены в ДНК последовательности ГАГГАГ последовательностью ГТГГАГ. Поскольку имеется эндонуклеаза, специфически действующая на последовательность ГАГГ, способность этого фермента разрезать ДНК можно использовать для выявления гомозиготности по гену глобина bs.

Еще одна возможность вытекает из того факта, что 64% гетерозиготных носителей гена bs имеют вторую мутацию на расстоянии примерно 5000 нуклеотидов от первой (Y. W. Kan, личное сообщение). Эта вторая мутация распознаваема с помощью эндонуклеазного метода и сигнализирует о присутствии гена bs. ДНК плода, гомозиготного по bs, под влиянием эндонуклеазы распадется на определенные фрагменты.

- Рекомендуем далее ознакомиться со статьей "Нарушение структуры эритроцитов у женщин и мужчин - прогноз беременности"

Оглавление темы "Беременность при патологии эритроцитов":