В ряде случаев, особенно при анализе сложных случаев транслокаций с вовлечением нескольких хромосом, возникает необходимость использовать в процессе гибридизации большое число флюоресцирующих ДНК-зондов, которые прокрашивают хромосому практически целиком. Подобная модификация FISH-метода называется супрессорной гибридизацией.

С помощью молекулярно-цитогенетического метода можно анализировать как нормальные клетки, так и выявлять аномальные хромосомы в любых типах клеток и, что особенно важно подчеркнуть, даже на стадии интерфазы клетки. Интерфазная клетка - это клетка, не находящаяся в стадии клеточного деления. Таким образом, используя современные методы молекулярно-цитогенетического анализа, отпадает необходимость культивирования клеток, применения сложных методов окраски и т.д., что весьма эффективно для дородовой и преимплантационной диагностики хромосомных аномалий.

Таким образом, совершенствование диагностики было связано с возрастанием разрешающей способности методов. Так, при рутиннной окраске хромосом под микроскопом обнаруживался дефект хромосомы размером 30x106 нуклетоидов, при использовании методов с дифференциальным окрашиванием хромосом - выявлялся дефект размером 7-10x106 нуклетотидов, при применении метода анализа хромосом на стадии ранней метафазы или прометафазы - 1-3x106 нуклеотидов. Следующим шагом стал молекулярно-цитогенетический метод, который имеет большие разрешающие способности, начиная от определения локализации генов до расшифровки сложных перестроек хромосом, и нашедший сейчас широкое распространение.

Потребность в цитогенетических исследованиях с каждым годом будет возрастать, особенно в связи с расширением объема пренатальной диагностики врожденной и наследственной патологии у плода. Поэтому целесообразно организовывать цитогенетические лаборатории при крупных многопрофильных медицинских учреждениях и медико-генетических центрах. В Российской Федерации в настоящее время цитогенетические анализы выполняются в медико-генетических центрах, консультациях, кабинетах и ряде перинатальных центров.

ДНК-диагностика основана на методах, которые позволяют идентифицировать строго определенный фрагмент ДНК. Это достигается с помощью блот-гибридизации или амплификации. Блот-гибридизация является очень чувствительным методом, позволяющим обнаружить последовательность ДНК в количестве нескольких пикограмм. При амплификации происходит многократное увеличение (в миллионы раз) количества анализируемого фрагмента ДНК, после которого возможен его анализ с помощью электрофореза и рестрикции. Амплификация фрагмента ДНК достигается за счет работы фермента ДНК-полимеразы, который в присутствии предшественников ДНК - дезоксинуклеотидтрифосфатов - может синтезировать на однонитевой матрице ДНК комплементарную нить.

Для начала такого синтеза необходима затравка - небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты, уже присоединившейся к однонитевой ДНК. Такие затравки называются праймерами, и их можно синтезировать искусственно. Для амплификации используются два разных праймера, гибридизирующихся на противоположных концах комплементарных нитей данного фрагмента на некотором расстоянии друг от друга, так, чтобы синтез происходил в направлении от одного праймера к другому.

Большие перестройки генома (делеции, инсерции, дупликации, транслокации) размером более 1 Мв, затрагивающие целые гены или несколько генов, могут определяться цитогенетическим анализом на прометафазных хромосомах. Эффективность выявления этих нарушений может повышаться при исследовании клеток в интерфазах с использованием флюоресцентной гибридизации in situ (FISH-метод).

Для выявления точковых мутаций и небольших делеции могут использоваться различные способы, однако все они основаны на использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутации. Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нуклеотидных последовательностей ДНК.
Точковые мутации, локализованные в сайтах рестрикции, могут идентифицироваться только при наличии ДНК-зондов.

ДНК-зонды - это клонированные последовательности геномной ДНК, изолированные из области локализации гена. Они тесно сцеплены с геном или даже являются его фрагментом. С помощью ДНК-зондов могут быть также выявлены и полиморфные локусы, которые, в свою очередь, могут использоваться как генетические маркеры определенных участков хромосом.

Заключительным этапом молекулярно-генетического анализа мутаций является определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), который сравнивается с нормой, и формулируется окончательный генетический диагноз.

В тех случаях, когда локализация повреждения неизвестна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание в сочетании с семейным анализом, то есть используется косвенный метод. ДНК-диагностика основана на методах, которые позволяют идентифицировать строго определенный фрагмент ДНК. Это достигается с помощью блот-гибридизации или амплификации.

- Читать далее "Прямые методы ДНК-диагностики. Косвенные методы ДНК-диагностики"