Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
Используемое для смены температур оборудование может быть как очень простым (водяные бани с разной температурой при неавтоматизированном режиме), так и весьма сложным (блоки для нагревания с быстрой сменой температуры, контролируемой с помощью микропроцессора, при автоматизированной амплификации; их производят фирмы Perkin—Elmer Cetus Instruments, Techne, Koch-Light и другие).
Процедура получения меченых зондов с помощью ПЦР описана в протоколе. Частой причиной неудач бывает недостаточное прогревание реакционной смеси на этапе денатурации. Для успешной денатурации смесь должна быть нагрета до примерно 93 С и затем быстро охлаждена до температуры отжига. Чтобы уменьшить испарение, на реакционную смесь наслаивают 50 мкл минерального масла.
Температура отжига зависит от длины праймера и его GC-содержания.
Однако на практике для каждого набора олигонуклеотидных праймеров (обычно длиной примерно 20 п.н.) эта температура подбирается экспериментально. Поскольку праймеры присутствуют в реакционной смеси в большом избытке, их отжиг происходит практически мгновенно, так что время отжига может быть очень небольшим.
Удлинение праймера при 72 С происходит в условиях, близких к температурному оптимуму для ДНК-полимеразы Taq. Время инкубации при этой температуре зависит от длины амплифицируемого фрагмента ДНК: копирование каждых 1000 п.н. занимает ~ 1 мин. Если длина фрагмента менее 150 п.н., то этап удлинения праймера можно вообще опустить, поскольку для полного удлинения отожженного праймера в этом случае вполне достаточно тех нескольких секунд, которые образец находится при 70—75 С во время перехода от температуры отжига к температуре денатурации.
Описаны также эффективный метод получения с помощью ПЦР зондов, меченных дигоксигенином, и простой метод очистки неизотопно меченных фрагментов с помощью электрофореза в легкоплавком агарозном геле.
При полимеразной цепной реакции может происходить амплификация всего одной молекулы ДНК, поэтому необходимо исключить загрязнение реактивов следовыми количествами посторонней ДНК, которая могла бы служить матрицей.
![меченные зонды](Img/384.jpg)
Получение меченых зондов с помощью ПЦР
А. Радиоактивное мечение
Материалы
• 20 х реакционный буфер (20 х РБ): 1 М КС1, 200 мМ трис-НС1, рН 8,3, 30 мМ MgCl2, 0,2% (в/о) желатина, по 4 мМ dATP, dTTP, dGTP
• ДНК-матрица
• Смесь праймеров: по 20 мкМ каждого из 5 - и 3 -праймеров
• dCTP (удельная радиоактивность >3000 Ки/ммоль; 110 ТБк/ммоль; 10 мкКи/мкл)
• ДНК-полимераза Taqr. 2 ЕД/мкл
• Минеральное масло
• Стоп-буфер: 300 мМ ЭДТА, рН 8,0
Методика
1. В микроцентрифужную пробирку на 500 мкл вносят при комнатной температуре в указанном порядке следующие реактивы:
• 20 х РБ 1 мкл
• Вода 1 мкл
• Смесь праймеров 2 мкл
• dCTP 15 мкл (150мкКи)
• ДНК-матрица 1 мкл (2 нг)
2. Инкубируют смесь при 93 °С 10 мин и добавляют ДНК-полимеразу Tag 0,5 мкл (1 ЕД)
3. Проводят 30-35 циклов ПЦР при эмпирически подобранных для данных праймеров температурах отжига, удлинения и денатурации, например:
Отжиг 1 мин при 50 °С
Удлинение 2 мин при 72 °С
Денатурация 1 мин при 93 °С
4. Инкубируют 10 мин при 72 °С, чтобы обеспечить полное удлинение.
5. Останавливают реакцию, добавив 2 мкл стоп-буфера. Очищают зонд от невключившихся нуклеотидов переосаждением этанолом или хроматографией на сефадексе.
6. Перед гибридизацией денатурируют меченую ДНК прогреванием в течение 5 мин при 95-100 °С с последующим резким охлаждением во льду в течение 5 мин.
Б. Нерадиоактивное мечение
Материалы
Все, как описано выше для радиоактивного мечения, со следующими изменениями: Для биотина:
• 20 х РБ: 1 М КС1, 200 мМ трис-HCl, рН 8,3, 30 мМ MgCl2, 0,2% (в/о) желатина, по 4 мМ dATP, dCTP, dGTP, 2,6 мМ dTTP, 1,4 MMbio-ll-dUTP
Для дигоксигенина:
• 20 х РБ: 1 М КС!, 200 мМ трис-HCl, рН 8,3, 30 мМ MgCh, 0,2% (в/о) желатина, по 4 мМ dATP, dCTP, dGTP, 2,6 мМ dTTP, 1,4 MMdig-11-dUTP
Методика
1. В микроцентрифужную пробирку на 500 мкл вносят в указанном порядке следующие реактивы:
• 20 х РБ (с dig-11 -dUTP или bio-11 -dUTP) 1 мкл
• Смесь праймеров 2 мкл
• ДНК-матрица 1 мкл (2 нг)
• Вода 16 мкл
2. Далее — как для радиоактивного мечения, начиная с п. 2.
- Читать далее "Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы"
Оглавление темы "Мечение нуклеиновых кислот":1. Основные методы мечения нуклеиновых кислот. Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК
2. Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом
3. Мечение двухцепочечной ДНК. Метод нуклеотидного замещения
4. Метод рассеянной затравки двухцепочечной ДНК. Получение меченых зондов методом рассеянной затравки
5. Мечение ДНК с использованием фрагментов. Получение зондов с помощью ПЦР
6. Температура получения меченых зондов. Технология получения меченных зондов с помощью ПЦР
7. Кодируемые бактериофагами ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Получение ДНК-матрицы
8. Получение РНК-зондов. Нерадиоактивное мечение РНК зондов
9. Преимущества РНК-зондов. Типы олигонуклеотидных зондов и их применение
10. Мечение 5'-концов. Мечение 5-концов при участии полинуклеотидкиназы фага Т4