В основе всех описанных методов лежат соответствующие ферментативные реакции. Отметим несколько общих правил, помогающих достичь высокой эффективности мечения и воспроизводимости результатов.

Реактивы должны вноситься в реакционную смесь в строгом соответствии с протоколом. Чтобы уменьшить число манипуляций с радиоактивными растворами, меченые соединения следует вносить предпоследними, непосредственно перед добавлением фермента. Очень важно тщательно перемешать все реактивы перед добавлением фермента (непродолжительным встряхиванием с последующим центрифугированием на микроцентрифуге при 12 000 g в течение 2 с).

Смешивание реакционной смеси с ферментом проводят осторожным двух- или трехкратным пипетированием. Низкий уровень мечения обычно обусловливается загрязнениями препаратов ДНК (или РНК). В этом случае можно провести очистку фенолом и переосаждение этанолом. Эффективность мечения повышается также при увеличении времени реакции или использовании больших количеств фермента.

Если метод мечения только отрабатывается или если используются новые препараты, очень важно определить эффективность мечения. В протоколе описана обычно используемая при работе с радиоактивно меченными зондами процедура — осаждение трихлоруксуснои кислотой (ТХУ). Параллельные пробы обычно берут несколько раз по ходу реакции или по ее окончании, а исходный уровень нерастворимого в ТХУ радиоактивного материала определяют до момента добавления фермента.

Если метод уже отработан, то эффективность включения метки можно не определять. В случае нерадиоактивных зондов уровень включения метки и средний размер фрагментов можно определить сравнением с известными мечеными стандартами с помощью Саузерн-блоттинга. Невключившуюся метку при необходимости удаляют, как это описано в протоколе. Как показывает наш опыт, такая очистка приводит к снижению фона при гибридизации на фильтрах и in situ.

Определение уровня включения нуклеотидтрифосфатов в ДНК преципитацией в ТХУ

Материалы
• Фильтровальная бумага ватман 540
• 5% трихлоруксусная кислота, 1% пирофосфат натрия (раствор ТХУ). NB! Кислота едкая.

Методика
l. Ha небольшой подписанный карандашом кусочек фильтровальной бумаги ватман 540 наносят 0,5 мкл реакционной смеси для мечения.
2. При работе с 32Р-зондами определяют радиоактивность фильтра, используя эффект Черенкова (т. е. без сцинтиллятора). Это позволяет определить суммарную активность образца. Если определяется уровень включения 3SS или 3Н, то фильтры высушивают и определяют радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика. Для промывания ТХУ используют второй такой же фильтр.

3. Промывают фильтр в 20 мл раствора ТХУ в одноразовой пробирке с завинчивающейся крышкой, сливают раствор и заливают фильтр свежей порцией раствора. Процедуру повторяют как минимум пять раз, пока не прекратится смывание с фильтра радиоактивных веществ.

4. Высушивают фильтр и еще раз измеряют его радиоактивность, используя эффект Черенкова, чтобы определить число импульсов в кислотонерастворимой фракции (включившуюся в зонд метку).

- Читать далее "Очистка от невключившихся нуклеотидов. Центрифугирование на колонках с сефадексом"