Никакой детальной методики выявления количественных или структурных хромосомных аберраций в солидных опухолях не опубликовано. Вообще говоря, замороженные срезы можно фиксировать в метаноле/ацетоне или в более сильном фиксаторе — формальдегиде. Протеолиз не должен быть слишком сильным, чтобы не произошла полная утрата морфологии. В протоколе дана примерная методика гибридизации in situ на замороженных срезах, исходя из которой можно подобрать оптимальные условия процедуры.
Гибридизация in situ на замороженных срезах
Материалы
• Предметные стекла, покрытые поли-L-лизином или органосиланом
• Пепсин из слизистой желудка поросенка (2500—3500 ЕД на 1 мг белка)
• 0,01 М НС1
• Метанол : ацетон (1:1) при -20 °С
• 1 % формальдегид в ФСБ

Методика
1. Монтируют замороженные срезы толщиной 4—6 мкм на предметных стеклах, покрытых поли-L-лизином или органосиланом,
2. Оставляют на ночь при комнатной температуре.
3. Фиксируют срезы в смеси метанол : ацетон (1:1) при -20 С в течение 20 мин.

4. Промывают препараты в двух сменах ФСБ, 0,5% твин-20, по 5 мин в каждой.
5. Инкубируют препараты с пепсином (50-400 мкг на 1 мл 0,01 М НСl) в течение 10 мин при 37 °С. Оптимальные условия протеолиза подбирают опытным путем.
6. Промывают стекла в пяти сменах воды и в пяти сменах ФСБ, налитых в глубокие стаканы.
7. Фиксируют срезы 1 % формалином в ФСБ в течение 10 мин при комнатной температуре.

8. Промывают препараты в пяти сменах ФСБ, затем в пяти сменах воды, налитых в глубокие стаканы.
9. Дегидратируют срезы в трех сменах этанола, 70%, 90% и 100%, по 3 мин в каждой, затем высушивают на воздухе.
10. Наносят на срезы по 5—10 мкл гибридизационной смеси, содержащей 1-3 нг ДНК-зонда, накрывают покровными стеклами и промазывают стекла по краям резиновым клеем.
11. Проводят денатурацию при 70-80 °С в течение 2-4 мин.
12. Оставляют для гибридизации во влажной камере при 37 С на ночь.

- Для лучшего прилипания срезов стекла можно активировать глутаральдегидом.
- Если во время гибридизации морфология препарата очень сильно искажается, можно провести фиксацию 1% формалином в ФСБ в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Чтобы немного повысить проницаемость срезов, препараты можно погрузить на 15 мин в смесь 0,1 М НСl, 0,05% тритон Х-100 (или твин-20).

- Для лучшего сцепления срезов со стеклом предметные стекла можно предварительно прогреть при 80 С в течение 30—60 мин.
- Обычно денатурацию проводят прогреванием препарата при 70 С в течение 3 мин. Зонд и мишень можно денатурировать по отдельности. Мишень денатурируют, погрузив препараты на 3 мин в смесь 70% формамида и 2 х SSC, а затем проведя их через батарею спиртов при 4 °С.
- Для выявления высокоповторяющихся последовательностей в околоцентромерных областях хромосом достаточно двухчасовой гибридизации.

- Читать далее "Суспензии изолированных клеток опухоли. Парафиновые срезы опухоли"