Материалы
• Буфер А: 4 х SSC, 0,05% твин-20, рН 7,0
• 10 х ФСБ: 1,5 М NaCl, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2
• Обезжиренное сухое молоко
• ФИТЦ-конъюгированный авидин (Vector Laboratories)
• Биотинилированные козьи антитела к авидину (Vector Laboratories)
• Реагент, предотвращающий выцветание, и контрастирующее вещество.

Методика
1. Промывают препараты в буфере А в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Инкубируют препараты и 5% (в/о) обезжиренном сухом молоке, растворенном в буфере А, в течение 15 мин при 37 С.
3. Инкубируют препараты с комплексом ФИТЦ—авидин, растворенным в буфере А (5 мкг/мл), в течение 20 мин при 37 С,

4. Промывают препараты в трех сменах буфера А, по 5 мин в каждой.
5. Усиливают сигнал 20-минутной инкубацией препаратов при . 37 °С с биотинилированными козьими антителами к авидину, разведенными буфером А в отношении 1:100. Промывают препараты в трех сменах буфера А, по 5 мин в каждой, и вновь инкубируют их в течение 20 мин при 37 С с комплексом ФИТЦ—авидин (5 мкг/мл в буфере А).
6. Промывают препараты в двух сменах буфера А, по 5 мин в каждой, а затем 5 мин — в ФСБ.

7. Проводят препараты через серию спиртов, 70%, 90%, 100% этанол, по 3 мин в каждом, и высушивают их на воздухе.
8. Заключают препараты в трис-НCl-глицерин, содержащий реагент, предотвращающий выцветание, и контрастирующее вещество.

Иммуноцитохимическая детекция: парафиновые срезы (пероксидазная метка)

Материалы
• Буфер В: 1 х ФСБ, 0,05% твин-20
• Нормальная кроличья сыворотка (НКС)
• 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорид и пероксид водорода
• 0,1 М имидазол

• Гематоксилин (Merck)
• Среда для заключения препаратов (BDH, Poole, UK)
• Мышиные антитела к биотину (Dakopatts)
• Конъюгированные с пероксидазой кроличьи антитела к иммуноглобулину мыши (Dakopatts)

Методика
1. Промывают срезы в буфере В при комнатной температуре в течение 5 мин.
2. Инкубируют препараты в течение 15 мин при комнатной температуре с 2% НКС, растворенной в буфере В.
3. Инкубируют препараты в течение 45 мин при 37 С с мышиными антителами к биотину, разведенными в буфере В в отношении 1:100.

4. Промывают препараты втрех сменах буфера В, по 5 мин в каждой.
5. Инкубируют препараты в течение 45 мин при 37 С с меченными пероксидазой кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши, разведенными в буфере В в отношении 1:80. Промывают препараты в трех сменах буфера В, по 5 мин в каждой3'.
6. Инкубируют препараты в 0,05% ДАБ, 0,1 М имидазоле, 0,05% Н2О2, рН 7,6, в течение 5-10 мин в темноте.
7. Промывают препараты в трех сменах ФСБ, по 5 мин в каждой, контрастируют гематоксилином и заключают в среду.

В менее жестких условиях, например при 37 С в 50% формамиде, 2 х SSC, избежать гибридизации с побочными сайтами связывания не удается.
Девять частей глицерина, содержащего 2,3% (в/о) 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октана (ДАБЦО), растворяют при 70 °С в одной части 0,2 М трис-HCl, 0,02% NaN, pH 8,0. Добавляют 4",6-диамино-2-фенилиндол (дающий синюю флуоресценцию ДНК, контрастирующую с красной флуоресценцией ФИТЦ или родамина) или пропидиумиодид (дающий красную флуоресценцию ДНК, контрастирующую с флуоресценцией ФИТЦ), в концентрации примерно 0,5 мкг/мл.

При гибридизации с двумя мишенями, когда в качестве зондов используется ДНК, меченная биотином и дигоксигенином, реагенты для цитохимической детекции наслаивают в следующем порядке: а) моно- или поликлональные антитела к дигоксигенину (Boehringer Mannheim); б) конъюгированные вторые антитела к антидигоксигенину; в) конъюгированный авидин. Инкубации 2 и 3 можно проводить одновременно (в 4х SSC).

Используя зонды, меченные разными гаптенами, которые визуализируют с помощью разных аффинных систем, можно одновременно детектировать несколько мишеней в одной и той же клетке, распластанной хромосоме или на тканевом срезе. Прекрасные результаты дает использование таких сочетений, как флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) с родамином или с техасским красным. С помощью ФИТЦ, родамина и АМК удается выявлять одновременно три и даже четыре разных ДНК-зонда. Гибридизацию in situ с несколькими мишенями можно использовать также для обнаружения количественных и структурных хромосомных аномалий и для установления корреляций между ними.

- Читать далее "Фиксация и обработка опухолевых препаратов. Предварительная обработка клеток опухоли"