Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР был предложен в 1983 г. американским исследователем Кари Муллисом. Суть этого метода заключается в специфической амплификации ДНК с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы З'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. Используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность, можно увеличить количество копий изучаемого фрагмента ДНК в сотни миллионов раз. Такое увеличение, позволяющее визуализировать заданный фрагмент ДНК на электрофореграмме, а также использовать продукт амплификации для дальнейшего изучения с помощью других методов, можно считать главным достоинством метода ПЦР. Основной недостаток этого метода - необходимость знания ДНК-последовательностей, фланкирующих изучаемый ген, для создания праймеров.

Для проведения специфической амплификации необходимы:
1) матричная ДНК-мишень (достаточно даже одной молекулы) длиной от 100 до - 35 000 п.н.;
2) два искусственно синтезированных праймера - олигонуклеотидные последовательности длиной 15-30 п.н.;
3) термостабильная ДНК-полимераза (чаще используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus, или Taq), сохраняющая свою активность при температуре 94 °С и выше;
4) четыре дезоксирибонуклеотида.

ПЦР состоит из многократных повторений цикла, состоящего из трех этапов:
1) денатурации (плавления) двухцепочечных структур - перевод их водноцепочечную форму путем нагревания до температуры 94 °С;
2) ренатурации или гибридизации (отжига) комплементарных участков ДНК с праймерами при температуре 37—68 °С;
3) синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК при 72 °С.

В первом цикле праймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК и образуют так называемые «длинные матрицы». В последующих циклах праймеры спариваются с вновь синтезированными молекулами ДНК, образуя «короткие матрицы». При этом синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДН К-полимеразой границы амплифицированного участка. Скорость синтеза определяется длиной амплифицируемого фрагмента. Как правило, ПЦР включает 25—30 циклов, и к последнему циклу в реакционной смеси содержатся практически только «короткие матрицы» (амплифицируемые фрагменты).

ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы — термоциклеры или амплификаторы ДНК, позволяющие задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждого этапа цикла.

Существует ряд модификаций ПЦР, используемых в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от метода последующего молекулярного анализа амплификатов.
Одна из широко используемых модификаций ПЦР - метод мультиплексной амплификации (МПА), позволяющий проводить ПЦР нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке, что не только убыстряет и удешевляет анализ, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получающиеся в результате МПА, в качестве положительного контроля реакции для других. Добавляя в реакционную смесь меченые dNTP, можно при необходимости получать меченые продукты ПЦР,

Проведение ПЦР с молекулами кДНК позволяет анализировать экспрессию генов и получать большие количества кДНК.

Реакцию амплификации можно проводить непосредственно на хромосомных препаратах и при использовании меченых нуклеотидов визуализировать комплементарные продуктам амплификации участки ДНК на хромосомах, (метод PRINS - от англ. polymerase reaction in situ).

Существуют варианты ПЦР (ассиметричная ПЦР - с избытком одного из олигопраймеров; ПЦР с использованием магнитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином и биотиновой метки одного из праймеров), позволяющие синтезировать и выделять преимущественно однопепочечные фрагменты ДНК, что значительно облегчает их секвенирование. В ряде случаев применяют метод GAWTS (от англ, genome amplification with transcript sequences) - амплификацию с праймерами, несущими сайт узнавания для фермента Т7-РНК-полимеразы, с последующим секвенированием одноцепочечного РНК-транскрипта, полученного из амплификата при помощи Т7-РНК-полимеразы.

Продукты ПЦР и любые другие фрагменты ДНК наблюдают в геле после проведения гель-электофореза и специфического окрашивания. При окрашивании геля бромидом этидия и просмотре в проходящем ультрафиолетовом свете места локализации ДНК выявляются в виде красной полосы.

На электрофореграмме можно определять наличие или отсутствие амплифицированного фрагмента в изучаемом образце, обусловленное протяженными делениями и структурными перестройками, регистрировать изменение его длины. Причинами отклонения в размерах синтезированных молекул могут быть: 1) инсерции или делеции нескольких нуклеотидов в исходной матричной молекуле ДНК, 2) конформационные изменения в одноцепочечных молекулах ДНК, возникающие при замене оснований, 3) структурные изменения в дуплексах между нормальными и мутантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. Таким образом, ПЦР представляет собой не только метод амплификации (синтеза), но и альтернативный метод анализа геномной ДНК. Однако в некоторых случаях для установления конкретной причины выявленных на электрофореграмме отклонений в размерах полученных фрагментов ДНК необходимо дальнейшее изучение продуктов амплификации с помощью блот-гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами, рестрикционного анализа, SSCP и других методов (в зависимости от цели).

Рестрикция ДНК. Рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеазы, - ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью и участвующие в системе распознавания и защиты «своих» и уничтожения чужеродных ДНК in vivo. Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, каждая из которых узнает свою специфическую последовательность в двухцепочечной молекуле ДНК. Длина распознаваемого участка варьирует от 4 до 12 нуклеотидов. Обнаружив эту последовательность, рестриктаза разрезает молекулу ДНК на фрагменты в местах ее локализации, называемых сайтами рестрикции. Чем больше сайтов рестрикции, тем больше образуется рестрикционных фрагментов. Длина рестрикционных фрагментов зависит от распределения сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК: образующиеся фрагменты тем короче, чем чаще расположены эти сайты. В зависимости от частоты расположения сайтов рестрикции в молекуле ДНК выделяют три класса рестриктаз: частощепящие — как правило, узнают короткие специфические последовательности длиной в 4—5 п.н. (например, Taq1); среднещепящие — узнают средней длины (6-7 п.н.) специфические последовательности (например, EcoR1); редкощепящие — узнают длинные специфические последовательности в 8-12 п.н. (например, Noil).

Сайты рестрикции часто используют в качестве генетических маркеров ДНК, так как образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле в зависимости от их молекулярной массы. Зная молекулярную массу фрагментов, можно определить физическое расстояние между сайтом рестрикции и концами исходного фрагмента ДНК, что является основой метода, получившего название физического картирования.

При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, например ДНК человека, часто- или среднеделящими эндонуклеазами образуется огромное количество фрагментов различной длины (в среднем порядка 1 млн). Разделить эти фрагменты с помощью электрофореза и визуально идентифицировать каждый из них невозможно: на электрофореграмме видна полоса, равномерно окрашенная по всей длине геля, - шмер. Обнаружение определенных фрагментов рестрицированной геномной ДНК на электрофореграмме возможно только путем гибридизации с мечеными ДНК- зондами.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."