Каждый аллель в анализируемых образцах ДНК можно точно идентифицировать, сравнив положение на окрашенной серебром электрофореграмме амплифицированных фрагментов ДНК матери, ребенка и предполагаемого отца с положением фрагментов маркерной смеси аллелей. Например, из рисунка для случая подтвержденного отцовства видно, что у матери присутствуют аллели 6 и 9. У ребенка выявлены те же аллели, тогда как у предполагаемого отца — аллели 3 и 9. Поскольку ребенок мог унаследовать аллели 6 и 9 от своей матери, у биологического отца один из этих аллелей должен отсутствовать.

У предполагаемого отца аллель 9 действительно отсутствует и, следовательно, он может быть отцом ребенка. При этом вероятность того, что предполагаемый отец является биологическим отцом, определяется частотой встречаемости аллеля 9 в его этнической группе.

Для случая неподтвержденного отцовства мать гомозиготна по аллелю II, у ребенка найдены аллели И и 3, у предполагаемого отца — аллели 3 и 11. Аллель 11 ребенок получил от своей матери и, следовательно, от биологического отца он должен был получить аллель 3. Но у предполагаемого отца этот аллель отсутствует, и, следовательно, отцовство должно быть исключено.

Вероятность правильного установления отцовства или идентификации личности зависит от того, насколько точно определены частоты аллелей или генотипов. В статье приведены данные по частоте аллельных вариантов локуса D1S80, полученные при анализе проб крови у лиц, случайно отобранных в более чем 500 населенных пунктах на территории США, и основанные на изучении более чем 400 аллелей в следующих этнических группах: афро-американцы, латиноамериканцы, белые американцы. Вероятность правильного исключения отцовства или идентификации личности при анализе локуса DlS80 составляет при этом 0,6028 для белых американцев, 0,7837 для афроамериканцев, 0,7250 для латиноамериканцев.

Обычно для получения достаточно достоверных результатов при установлении отцовства с использованием метода ПЦР-ПДАФ анализируют четыре или пять независимо наследуемых локусов. Описанные в этой главе основные принципы метода и конкретные методики можно использовать и для идентификации личности при проведении судебно-медицинских экспертиз.

Последние успехи молекулярной биологии позволяют по-новому взглянуть на патогенез многих заболеваний. Например, показано, что развитию опухолей предшествуют генетические нарушения, приводящие к изменению структуры онкогенов и генов — супрессоров опухолей (анти-онкогенов). Это открытие было сделано в значительной мере благодаря созданию новых методов быстрого выявления генетических нарушений в биоптатах опухолевых тканей.

В этих статьях описано применение молекулярных методов для исследования опухолей, причем особое внимание уделено тем методам, которые пригодны для работы с обычным архивным материалом. Прежде всего мы остановимся на выявлении точковых мутаций в свежеполученных архивных образцах. Далее рассмотрим методы выявления амплификации генов, а затем — потери гетерозиготности (ПГ) с помощью анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Выявление точковых мутаций

Для выявления точковых мутаций можно использовать как минимум три метода. Первый из них — метод аллель-специфичной гибридизации; в его основе лежит тот факт, что дуплекс, образующийся при отжиге олигонуклеотида с исследуемым генным локусом, становится крайне нестабильным при наличии всего одного неспаренного нуклеотида. Метод состоит из двух этапов:
а) амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР);
б) скрининг амплифицированной ДНК, фиксированной на фильтрах, путем ее гибридизации с изотопно меченными синтетическими олигомерами, которые соответствуют полипептидам с возможными аминокислотными заменами.

Второй метод — это прямое секвенирование ДНК, амплифицированной с помощью ПЦР. Простой и чувствительный третий метод был разработан сравнительно недавно и получил название анализа одноцепочечного конформаиионного полиморфизма (SSCP). Этот метод основан на одновременной амплификации и мечении определенных участков геномной ДНК при проведении ПЦР с мечеными dNTP и на том, что скорость движения одноцепочечных фрагментов в полиакриламидных гелях в неденатурирующих условиях зависит не только от их размера, но и от нуклеотидной последовательности.
До гибридизации необходимо выделить ДНК из клинических образцов и провести ее ПЦР-амплификацию.

- Читать далее "Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР"