Транскрипция in situ (ТИС) — сравнительно недавно разработанная модификация метода обычной гибридизации in situ. Она включает ГИС мРНК со специфическими олигонуклеотидными праимерами и последующую обратную транскрипцию в присутствии меченых нуклеотидов с образованием in situ меченой кДНК. кДНК-транскрипт можно наблюдать визуально или элюировать для дальнейшего анализа с помощью блот-гибридизации или амплификации.

Этот метод позволяет локализовать специфические мРНК и особенно удобен в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность мРНК известна только частично или когда возможен альтернативный сплайсинг мРНК. В принципе с помощью транскрипции in situ можно, используя короткие дискриминирующие праимеры, выявлять транскрипты мутантных аллелей одного гена и определять содержание мРНК в срезах ткани.

Нами разработана методика транскрипции in situ с использованием неизотопно меченных нуклеотидов для выявления суммарной мРНК. в МСР7-клетках при помощи oligo(dT)-праймеров. Оптимальные условия проведения такого анализа, подобранные эмпирически, представлены в протоколе.

При работе с культурами клеток для фиксации лучше использовать параформальдегид, а не метанол/уксусную кислоту. Включение процедуры тепловой денатурации, эффективной при ГИС с рибо-зондами, приводит к резкому усилению фона, даже когда гибридизацию осуществляют при 50 С. Это связано с тем, что при нагревании происходит денатурация ядерной ДНК и усиливается неспецифическое связывание праймера и неспецифический синтез меченых продуктов при транскрипции. Мы также обнаружили, что при гибридизации в присутствии формамида нет необходимости в длительном отмывании препарата в жестких условиях. Для транскрипции in situ мы использовали олигомеры длиной более 25 нуклеотидов, а отрицательным контролем служила транскрипция в отсутствие праймера или в присутствии в качестве праймера oligo(dA) длиной менее 25 нуклеотидов. Оптимальные условия элонгации (концентрация фермента, состав буфера для обратной транскрипции, время инкубации, система детекции) зависят от источника обратной транскриптазы. При детекции наилучшие результаты были получены при использовании в качестве субстрата быстрого красного, но вполне пригодны также НСТ/БХИФ (прямая пероксидазная система) и 3-амино-9-Этилкарбазол (АЭК) (непрямая пероксидазная система).

Неизотопная транскрипция in situ Материалы и исходные растворы

• Обработанная ДЭПКдеионизованная вода
• Олигомеры: oligo(dT)25-3o и oligo(dA) (Pharmacia, UK), растворенные в обработанной ДЭПК воде до концентрации 1,12 мкМ или 10 нг/мкл
• Деионизованный формамид
• 20 х SSC
• Гибридизационная смесь: 50% формамид, 4 х SSC, 2 нг/мкл олигомера
• 5 х буфер для обратной транскриптазы (5 х БОТ): 250 мМ трис-НС1, рН 8,3, 50 мМ MgCl2, 250 мМ КС1

• 25 мМ дитиотрейтол
• Смесь нуклеотидов: dATP, dCTP, dGTP по 2,5 мМ
• 1 мM TTP
• 1 мМ dig-11-dUTP (Boehringer Mannheim)
• Ингибитор РНКаз (типа RNAguard фирм ы Pharmacia, 35 ЕД/мкл)

• Обратная транскрипция вируса миелобластоза птиц (Pharmacia), 18 ЕД/мкл
• ТСБ, рН 7,2
• Блокирующий раствор (ТБТ)
• Щелочная фосфатаза, конъюгированная с антителами к дигоксигенину (Boehringer Mannheim)
• Буфер для быстрого красного: растворяют 2 мг нафтола AS-MX (Sigma N4875) в 0,2 мл диметилформамида и к полученному раствору добавляют 9,8 мл 0,1 М трис-HCl, рН 8,2. Добавляют 10 мкл 1 М левамизола, разливают на аликвоты и хранят до использования при —20 "С.
• Субстрат быстрый красный: 1 мг быстрого красного TR (Sigma F1500) растворяют в 1 мл буфера для субстрата, фильтруют и используют сразу после приготовления.

Культивированные клетки переносят на обработанные органосиланом предметные стекла с большим числом ячеек и фиксируют параформальдегидом, как описано в протоколе.

A. Гибридизация
1. В ячейки предметного стекла диаметром 12 мм вносят по 9 мкл гибридизационной смеси и накрывают покровным стеклом.
2. Инкубируют стекло во влажной камере при комнатной температуре в течение ночи (12-20 ч).

Б. Отмывание после гибридизации
1. Промывают предметные стекла в 2 х SSC, приготовленном на обработанной ДЭПК воде, два раза по 10 мин, при 20 С.
2. Промывают стекла 30 мин при 20 С в 0,5 х SSC.
3. Быстро (в течение 10—30 мин) при 20 °С высушивают стекла.

B. Обратная транскрипция
1. Готовят транскрипционную смесь следующего состава.
• 5 х БОТ 20 мкл
• Смесь нуклеотидов 10 мкл
• ТТР 2,5 мкл
• Dig-dUTP 1 мкл
• ДТТ 4 мкл
• Ингибитор РНКаз 0,5 мкл
• Обратная транскриптаза 3 мкл
• Вода до 100 мкл

2. В ячейки предметного стекла вносят по 9 мкл транскрипционной смеси и накрывают покровным стеклом.
3. Инкубируют во влажной камере (типа чашки Терасаки) при 37 °С в течение 15—30 мин (время инкубации подбирают опытным путем).

Г. Отмывание после транскрипции и детекция
1. Промывают стекла в 2 х SSC при 20 °С, два раза по 10 мин.
2. Промывают стекла в 0,5 х SSC при 40 С, два раза по 15 мин.
3. Промывают стекла в блокирующем растворе (ТБТ) в течение 10 мин.
4. Инкубируют 30 мин во влажной камере с разведенными в ТБТ (1:200) конъюгированными с щелочной фосфатазой антителами к дигоксигенину.
5. Дважды ополаскивают стекла в ТСБ.
6. Инкубируют стекла в свежеприготовленном растворе субстрата быстрый красный в течение 10—20 мин при 20 С.
7. Промывают стекла в проточной воде в течение 5 мин, высушивают при 37—75 С, окрашивают клетки гематоксилином и монтируют в глицериновом желе.

Возможность выявления методом неизотопной ГИС транскриптов определенных генов и установления корреляции между этими транскриптами, белками, морфологией клеток и тканей позволяет изучать широкий спектр различных патологических процессов. Более того, ГИС — это наиболее чувствительный метод обнаружения РНК, экспрессирующейся в небольшом числе клеток в многокомпонентной клеточной популяции, и способ изучения нестабильных или быстро секретируемых белков.

Анализ различий в экспрессии генов в норме и патологии все шире используется для изучения регуляции экспрессии генов и ее роли в патогенезе различных заболеваний. Перечислим некоторые области применения этого подхода.

а. Параллельная детекция специфических мРНК и соответствующих белков, позволяющая исследовать процессы дифференцировки клеток и тканей.
б. Изучение экспрессии клеточных онкогенов, позволяющее раскрыть механизмы неопластической трансформации клеток, разработать новые способы диагностики и классификации предраковых состояний и их дифференциации от ранних неоплазий, выявлять специфичные для разных типов опухолей маркеры, предсказывать клиническое течение и исход опухолевого процесса.
в. Изучение активации генов множественной лекарственной устойчивости, позволяющее выработать более эффективную стратегию терапии.
г. Исследование экспрессии цитокинов — белков межклеточной системы сигнализации — в норме и патологии.

- Читать далее "Гибридизация in situ для диагностики цитопатологий. Получение материала и подготовка цитопрепаратов"