Выявление мутаций, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, с помощью ПЦР-анализа невозможно: длина мугантного фрагмента ДНК остается прежней; нарушается лишь конформационная структура, а вместе с ней и некоторые физико-химические свойства молекулы ДНК. Для обнаружения мутаций в виде замен используют анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP) и метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE). Еще два метода выявления точковых мутаций - гетеродуплексный анализ (НА) и химическое расщепление некомплементарных сайтов (CMC) - основаны на возникновении структурных нарушений в месте негомологичного спаривания при гибридизации нормальной и мутантной цепей ДНК. Все эти методы анализа амплифицированных продуктов (кроме CMC-метода) для точной идентификации точковых замен в обязательном порядке предполагают секвенирование. Схематическое изображение принципов и методов идентификации точковых мутаций представлено на рисунке.

Анализ конфирмационного полиморфизма одноцелочечной ДНК (SSCP - от англ. single strand conformation polymorphism). SSCP-анализ — наиболее часто используемый метод для выявления точковых замен внутри фрагмента ДНК (как правило, размером от 50 до 300 п.н.), полученного в результате ПЦР. Этот метод, предложенный в 1989 году, чрезвычайно эффективен, так как основан на регистрации различий электрофоретической подвижности одноцелочечной ДНК исследуемого и контрольного образцов одинаковых по длине, но различающихся по нуклеотидному составу. Различие в нуклеотидной последовательности обусловливает разницу вторичной конформации одноцепочечных фрагментов, образующихся при денатурации (химической или температурной). Именно от вторичной конформации зависит электрофоретическая подвижность молекул ДНК в полиакриламидном геле. На процесс конформации также влияют различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов.

Эффективность выявления мутаций этим методом существенно зависит от размера анализируемого фрагмента: при его длине менее 200 п.н. она составляет 80-95%, а при размере более 400 п.н. - около50%.

После обнаружения фрагмента с измененной электрофоретической подвижностью, как правило, проводится секвенирование первичной последовательности ДНК мутантного фрагмента для определения конкретной нуклеотидной замены.

Гетеродуплексный анализ (НА - от англ. heteroduplex analysis). Метод НА позволяет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде (мутации в гомологичных генах различные по молекулярной природе и внутригенной локализации) или в гетерозиготном состоянии. Метод основан на выявлении различий электрофоретической подвижности гомодуплексов и гетеродуплексов, полученных при ПЦР. При амплификации небольших фрагментов генов гетерозигот и гомозиготных компаундов образуются три типа молекул ДН К; два типа гомодуплексов -из двух нормальных и из двух мутантных цепей, и молекулы, несущие мутацию лишь в одной из цепей (гетеродуплексы). Отличие электрофоретической подвижности гетеродуплексных молекул ДНК от обоих типов гомодуплексов обусловлено информационными особенностями вследствие наличия мест несовпадения нуклеотидов, Вероятность идентификации точковых мутаций методом НА при длине фрагментов ДНК «300 п.н. составляет 90-98%.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE — от англ, denaturation gradient gel electrophoresis). Метод DGGE — основан на различиях в условиях и характере денатурации нормальных и мутантных двухцепочечных фрагментов ДНК, выявляемых путем сравнения их электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов (мочевины и формальдегида). Скорость денатурации (или плавления) зависит от соотношения A-T/G-C пар в исследуемых фрагментах (G—С-связь более устойчива). При известной нуклеотидной последовательности для подбора условий плавления или определения скорости денатурации при выбранном градиенте концентрации применяют специальную компьютерную программу. Плавление даухцепочечных фрагментов ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления (температура, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью может соединиться или разойтись). После начала плавления продвижение двухцепочечного фрагмента ДНК в геле резко замедляется, вследствие изменения пространственной конфигурации молекулы, до момента полной денатурации. Скорость дальнейшего продвижения денатурированных фрагментов ДНК зависит от их нуклеотидного состава.

Для предотвращения денатурации концов молекул ДНК до достижения оптимальной области плавления (обусловлено определенным пуклеотидным составом фрагмента ДНК), к концам молекул ДНК присоединяют так называемые зажимы (синтетические фрагменты из GC-нуклеотидов размером в несколько десятков п.н,). Использование GC-зажимов позволяет выявить все мутации, локализованные вблизи концов амнотифицированных участков ДНК, и при длине цепи до 600 п.н. эффективность выявления мутаций методом DGGE достигает 95%.

К достоинствам этого метода, отличающим его от SSCP и НА, следует отнести возможность его использования для анализа крупных амплифицированных фрагментов ДНК и высокую чувствительность (позволяет улавливать точковые мутации, возникшие даже в одной из 100 обработанных мутагеном клеток, что используется при анализе индуцированных мутаций). Чаще всего DGGE применяют для скрининга мутаций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК. К недостаткам метода, ограничивающим его широкое применение в диагностике наследственных заболеваний следует отнести техническую сложность получения равномерного фадиента концентрации денатурирующего агента в полиакриламидном геле и высокую стоимость искусственно синтезированных GC-концов.

Химическое расщепление некомллемснтарных сайтов (CMC — от англ. chemical mismatch cleavage). Метод CMC основан на способности ряда химических агентов специфически разрывать цепь ДНК в месте локализации неспаренного основания; например, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, тимин - к действию осмия тетраоксида, а тимин и гуанин - к карбодиимиду. Тестируемые образцы ДН К (или РН К) смешивают с образцом радиоактивномеченного ДНК-зонда и создают условия для образования дуплексов (нагревание с целью полной денатурации и последующее охлаждение). При наличии мутации в тестируемых молекулах образуются гетеродуплексы с участками негомологичного спаривания, что и является мишенью для специфического химического агента. Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в данной точке и образованию двух коротких фрагментов, обнаруживаемых при электрофорезе и последующей радиоавтофафии. При определении длины каждого фрагмента не составляет труда установить локализацию мутации. Эффективность выявления мутаций методом CMC при использовании радиоактивно меченных ДНК-зондов составляет 95-100%.

Метод CMC пригоден для тестирования протяженных участков ДНК - до 2 т. п.н.. Кроме того, с помощью этого метода можно одновременно выявить и локализовать как несколько одинаковых мутаций, так и разных (при использовании нескольких ДНК-зондов-мультиплексный вариант метода) водном фрагменте ДНК, что можно отнести к огромным преимуществам метода. Основной недостаток метода CMC - высокая токсичность используемых химических агентов (карбодиимид менее токсичен).

Методу родственен метод расщепления гетеродуплексов РНКазой А: гетеродуплексы в этом случае образованы тестируемой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченной РНК-пробой, а РН Каза А разрезает молекулу РНК в местах нарушения спаривания оснований. Однако с помощью этого метода можно выявить лишь около 50% точковых мутаций.

Для первичной идентификации мутаций можно использовать и анализ аминокислотной последовательности продукта гена. Этот метод целесообразно применять для выявления редких (не мажорных) мутаций в протяженных генах с большим числом экзонов (ген миопатии Дюшенна, ген нейрофиброматоза I). Метод включает выделение тотальной мРНК из лейкоцитов крови, обратную транскрипцию, амплификацию специфических экзонов кДНК, встраивание амплифицированной области ДНК в экспрессируюшую систему и анализ образовавшегося продукта (выявление преципитации с антителами к домену белка).

- Читать далее "Секвенирование ДНК. Этапы секвенирования ДНК."