Метод вычитающейся гибридизации используется для поиска последовательности, соответствующей небольшой делеции в геноме. Вычитание — процесс повторяющихся этапов молекулярной гибридизации набора кДНК одного тестируемого (трейсер) образца с избытком кДНК другого сравниваемого (драйвер), контрольного образца. От образовавшихся гибридов отделяют фракцию, которая не участвовала в гибридизации. Она и содержит искомые последовательности.

Основными недостатками первых, получаемых с помощью этого метода обогащенных библиотек, то есть полного набора непрогибридизовавшейся популяции кДНК, являлась низкая степень представленных искомых последовательностей-мишеней, «неулавливание» редко встречающихся в клетке транскриптов, а также трудоемкость самого метода. В дальнейшем метод прошел ряд усовершенствований, направленных на их устранение.

Метод репрезентативного дифференциального анализа (Representational Differece Analysis — RDA) изначально был предназначен для поиска различий между двумя сложными геномами. Для обогащения искомыми последовательностями сравниваемые геномы упрощались путем разделения драйверной и трейсерной кДНК рестрикционными эндонуклеазами. К 5'-концам полученных фрагментов присоединяли дефосфорилированные короткие нуклеотидные последовательности известного состава, содержащие сайт узнавания определенной рестриктазы (адаптеры) и ставили ПЦР с гомологичными этим адаптерам праймерами.

После такой обработки драйвер и трейсер представляют смесь фрагментов приблизительно одинакового размера. Они использовались для вычитания. Далее адаптеры удаляют и к трейсерным ампликонам присоединяют новые адаптеры. После стадии гибридизации проводили ПЦР с праймером, который соответствовал части последовательности нового адаптера. Амплификации будут подвергаться только двухцепочечные гибриды трейсера, имеющие участки для связывания праймера. Каждый новый этап «вычитание-гибридизация» приводит к обогащению специфическими последовательностями, которые затем клонируют и анализируют.

Метод RDA успешно используется для конструирования кДНК библиотек, поиска и идентификации генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе различных биологических процессов или под воздействием внешних факторов.

Одним из высокотехнологических методов изучения ДГЭ считается Gene Calling. Он основан на возможности анализа остатков транскриптов, образующихся в процессе расщепления кДНК рестрикционными эндонуклеазами. После этого фрагменты генов лигируют и включают в метку, используя при этом 5-флюороскамин. С целью амилификации в реакции ПЦР в качестве адаптора используется 3-биотин. Конечный этап процесса — электрофорез в полиакриламидном геле.

К сожалению, все эти методы в полной мере не соответствуют задачам фармакологического анализа. При их применении трудно рассчитывать на полную идентификацию всех генов, экспрессирующихся в ответ на действие определенного лекарственного препарата и, соответственно, на понимание механизмов его действия. В то же время они дают возможность создания кДНК — библиотек и лишь с их помощью можно выявлять новые гены.

- Читать далее "Результат ДГЭ. Фармакогенетика"