Стволовые клетки можно изучать, идентифицируя белки, которые отличают их от других пролиферирующих клеток. Подобные белки могут быть внутриклеточными или (что более желательно) расположенными на поверхности. Эти белки делают клетки доступными для идентификации различными методами, в числе которых магнитная сепарация при помощи микроносителей и выделение флуоресцентно активированных клеток (FACS). Также стволовые клетки можно изучать на основании характеристик клеточной кинетики или на основании особенностей их митотической активности.

Стволовые клетки могут быть идентифицированы и выделены также на основании их физических свойств, таких как размер, плавучесть в растворе или же благодаря другим их свойствам, как в случае так называемой «боковой популяции» клеток, которые имеют активные Abcg2 транспортеры. Клетки-кандидаты, идентифицированные или выделенные любым из описанных выше способов, в дальнейшем могут быть более подробно охарактеризованы при помощи функциональных методов — культивирования колоний in vitro или реконструирования кожи in vitro либо in vivo.

а) Ассиметричное деление стволовых клеток. Иерархическая модель клеточной пролиферации в кожном эпителии подразумевает определенную степень клеточной, генетической или популяционной ассиметрии. Иерархическая модель стволовых клеток подразумевает, что уровень асимметрии обусловлен нечастым делением клеток или хромосомальной сегрегации. Так как действие стволовых клеток направлено на защиту всей ткани наряду с сохранением в любой ситуации клеточной ДНК, Cairns полагает, что эта популяция клеток обладает специальным механизмом для сегрегации ДНК и сохранения «бессмертной линии» в ходе каждого деления.

Хотя существуют убедительные доказательства того, что стволовые клетки молочных желез и кишечного эпителия могут содержать резерв «бессмертной» ДНК, недавние исследования мультипотентных стволовых клеток мышиного волосяного фолликула показали отсутствие там клеточной сегрегации. Более того, в лаборатории Tumbar был разработан метод отслеживания пролиферативной истории кератиноцитов утолщений волосяных фолликулов, при помощи которого получены прямые свидетельства нечастого деления этой популяции стволовых клеток.

б) Латеральная миграция стволовых клеток. Клеточная пролиферация и терминальная дифференцировка в эпидермисе часто происходят вместе в одном и том же вертикальном столбце ткани. При этом имеет место также и латеральная миграция в случае заживления ран, когда пласт пролиферирующего эпителия покрывает до того открытый дермальный слой, что приводит к восстановлению эпителиального покрытия и традиционному вертикальному росту и терминальной дифференцировке. Кроме того, Brash и соавт. предположили, что облучение эпидермиса ультрафиолетовыми лучами и нанесение специфических клональных заплат, каждая из которых обладает уникальной мутацией р53, позволяет отследить пролиферацию и дифференцировку клеток эпидермиса за пределами единичной пролиферативной единицы.

в) Обнаружение стволовых клеток в эпителии кожи. Эпидермальные стволовые клетки, характеризующиеся медленным обменом, впервые были идентифицированы на основании их кинетического поведения в рамках пролиферативных единиц. Именно за счет этого Mackenzie идентифицировал базальные митотические кератиноциты под гексагональными бляшками. Осуществив срезы ткани в вертикальном направлении, Christophers обнаружил, что некоторые базальные клетки, имеющие форму ручного зеркальца, обладают способностью окрашиваться флуоресцентными красителями, сходными с таковыми у клеток более высоко расположенных слоев. Эти данные были подтверждены Potten в 1974 году, который дал таким единицам в эпидермисе название «структурные эпидермальные пролиферативные единицы» (EPUs).

Он сосредоточил свое внимание на центральных базальных клетках, отметив, что они редко бывают митотическими и редко содержат меченный тритием тимидин (после его однократного пульсового введения). На этом основании автор сделал вывод, что эти покоящиеся центральные клетки могут обладать свойствами стволовых, в то время как периферические клетки обладают свойствами клеток, перемещающихся к поверхности. Следующий важный шаг в изучении структурных эпидермальных пролиферативных единиц наступил после идентификации в их центре клеток, удерживающих радиоактивные метки и отличающихся медленным обменом.

Bickenbach, а впоследствии Bickenbach и Mackenzie, Morris, и Pot-ten обнаружили, что введение в течение трех дней меченного тритием тимидина с последующим отслеживанием в течение 4-8 недель позволяет визуализировать центральные клетки в поле светового микроскопа посредством ауторадиографии. Последующее изучение центральных стволовых и периферических перемещающихся к поверхности клеток было выполнено при помощи большого количества различных техник как in vivo, так и in vitro. В некоторых участках тонкой кожи было доказано наличие структурных эпидермальных пролиферативных единиц, причем их диаметр достигал двух миллиметров. Общая концепция структурных эпидермальных пролиферативных единиц представлена на рисунке ниже.

Распределение эпидермальных стволовых клеток в пределах кожи остается предметом научных споров. Так Lavker и Sun показали, что митотические клетки и клетки, редко являющиеся митотическими (предполагаемые стволовые клетки), расположены соответственно в верхней и нижней частях эпидермальных гребней. Эти исследователи полагали, что глубже расположенные клетки физически лучше защищены, нежели поверхностные. Напротив, в дальнейших исследованиях было показано, что клетки, обладающие свойствами стволовых, в зависимости от локализации в эпидермисе могут различаться. Ghazizadeh и Taichman использовали меченные ретровирусом человеческие кератиноциты, которые наносили на кожу безтимусных «голых» мышей для визуализации пролиферативных единиц человеческой кожи. Этими авторами было показано, что предполагаемые стволовые клетки расположены повсюду в эпителии.

г) Маркеры и селективные детерминанты стволовых клеток. По сравнению с большим числом маркеров и селектируемых детерминант, выявленных в стволовых клетках волосяных фолликулов, лишь небольшое число аналогичных маркеров было идентифицировано в эпидермисе. Среди них особенно важными являются β-1 интегрин, CD71 (рецептор трансферрина) и LRIG1. β-1 интегрин является молекулой клеточной адгезии и может использоваться в качестве селектируемой детерминанты для увеличения числа кератиноцитов с высоким пролиферативным потенциалом in vitro в процессе создания искусственной кожи. Клетки, которые ярко окрашиваются флуоресцентно меченными антителами к β-1 интегрину, находятся на дне эпидермальных гребней или на вершине сосочков дермы — в зависимости от локализации изучаемого участка кожи. CD71 экспрессируется всеми клетками с пролиферативной способностью и может использоваться в сочетании с а-6 интегрином (внешним компонентом полудесмосом, представленных на базальных клетках эпидермиса) для обогащения клеток, которые реагируют с флуоресцентно меченными антителами к а-6 интегрину, однако не связываются с флуоресцентно меченным CD71.

За счет них увеличивается количество эпидермальных кератиноцитов, проявляющих как in vivo, так и in vitro свойства стволовых клеток. У мышей клетки с таким фенотипом расположены в утолщениях волосяных фолликулов. LRIG1 является маркером человеческих интерфолликулярных стволовых клеток и помогает поддерживать их в покоящемся состоянии. У мышей LRIGl-иммунореактивные клетки обнаруживаются в промежуточной зоне волосяного фолликула между сальными железами и волосяной воронкой.

д) Альтернативные механизмы регуляции пролиферации в эпидермисе. Модель стволовых клеток, описанная выше, неоднократно подвергалась сомнениям. Так Clayton и соавт. изучали клональное размножение эпидермиса хвоста мыши, сочетая это с математическим моделированием. Эти исследователи показали, что модель соотношения в эпидермисе хвоста мыши стволовых и движущихся к поверхности клеток несопоставима с реальными популяциями этих клеток. Кроме того, исследователи показали, что судьба клонов базальных клеток хвоста может быть различной: (1) обе клетки остаются пролиферативными; (2) обе клетки участвуют в дифференцировке и покидают репродуктивный цикл; (3) одна из клеток сохраняет пролиферативные свойства, а другая участвует в процессе дифференцировки. Таким образом, эпидермис на различных участках тела может иметь разные пролиферативные свойства и способность к терминальной дифференцировке.

До настоящего времени нет данных о том, что указанная модель подтверждена в отношении эпителия спины мыши или любого участка эпидермиса человека.

е) Взаимодействия в пределах различных компартментов эпителиальных стволовых клеток. Клеточная кинетика и данные исследований меченых клеток показали, что в эпидермисе человека существуют многочисленные компартменты стволовых клеток и клеток-предшественников. В условиях гомеостаза эти компартменты остаются в статичном состоянии на длительные промежутки времени без существенных взаимодействий. Также существуют многочленные пролиферативные единицы в структуре волосяных фолликулов, расположенные в области волосяной воронки, утолщений волосяных фолликулов, перешейка фолликула и сальных желез. Дочерние клетки всех этих пролиферативных единиц сальных желез и волосяных фолликулов осуществляют свой вклад в восстановление поврежденного эпидермиса.

ж) Регуляция стволовых и временно делящихся клеток эпидермиса. Идентификация и описание функциональных характеристик молекул, регулирующих деятельность стволовых клеток эпидермиса и перемещающихся к поверхности (временно делящихся) клеток, являются объектом интенсивного изучения. Изучаемые медиаторы участвуют в сложных биологических сигнальных путях, задействованных в процессах эмбриогенеза, морфогенеза, поддержании гомеостаза и восстановления тканей у взрослых организмов. Регуляторные «переключатели» включают: (1) стимуляцию, которая непосредственно заставляет дочерние клетки проходить конкретный путь дифференцировки; (2) молекулы и пути, характерные для гомеостатического состояния стволовых клеток; (3) молекулы, которые дифференцированно влияют на пролиферацию стволовых и перемещающихся к поверхности клеток; (4) позитивные и негативные регуляторы, определяющие вступление на путь терминальной дифференцировки. Примеры подобных регуляторных молекул приведены в таблице ниже.

з) Болезни кожи при нарушении пролиферации. Считается, что рак кожи обусловлен аберрантной пролиферацией стволовых клеток кератиноцитов. В этом отношении стволовые клетки являются кандидатами на роль клеток, инициирующих опухоль за счет своего долговременного персистирования в тканях и присущего им высокого пролиферативного потенциала. Связь между эпидермальными стволовыми клетками и так называемыми стволовыми раковыми клетками до сих пор не ясна. Однако считается, что тканевые стволовые клетки могут стать раковыми стволовыми клетками, сохранив такие свойства стволовых клеток, как способность к долговременному обновлению, продуцированию перемещающихся к поверхности и полностью дифференцированных клеток. Хотя стволовые клетки хорошо защищены против канцероген-индуцированного повреждения, будучи немногочисленной и хорошо защищенной популяцией, перемещающиеся к поверхности клетки обладают непродолжительным сроком жизни и подвергаются многочисленным мутациям, которые приводят к озлокачествлению.

Псориаз считается примером гиперпролиферации перемещающихся к поверхности клеток. Для этого заболевания помимо воспалительных и кожных изменений характерно также увеличение числа β-1 интегриновых тусклых клеток в надбазальных слоях эпидермис Кроме того, при псориазе повышено количество маркеров пролиферации, таких как Ki67 и С-myc.

- Вернуться в оглавление раздела "дерматология."

1. Свойства стволовых клеток эпидермиса
2. Признаки стволовых клеток и их выделение
3. Клеточная и генная терапия стволовыми клетками эпидермиса