Гены выделяют из геномов про- и эукариот, вирионных геномов и плазмид, содержащих от 3-4 (F-плазмиды, фактор бактериощшогенности) до 15-20 генов (R-плазмиды), способных интегрироваться с клеточным геномом и передаваться реципиентным клеткам благодаря наличию пилей (половых ворсинок) и tra-оперонов (англ. transfer - перенос).

При этом используются особые ферменты рестриктазы (лат. restrictio - разрыв), или эндодезоксирибонуклеазы, рассекающие молекулу ДНК на отдельные сегменты с липкими концами, к которым легко присоединяются другие рестриктазные фрагменты.

Первые рестриктазы получил Г. Смит, а применил их как «молекулярные ножницы» для получения генов и составления генных карт Д. Натане, за что они совместно с В. Арбером, открывшим механизм рестрикции, были удостоены в 1978 г. Нобелевской премии.

В настоящее время генные инженеры располагают сотнями рестриктаз. Каждая из них расщепляет ДНК независимо от ее происхождения по строго определенным сайтам (участкам) узнавания нуклеотйдных последовательностей. Величина получаемых при этом фрагментов ДНК зависит от частоты встречаемости сайтов узнавания в молекуле ДНК и ее длины.

Так, если сайт узнавания составляет 4 пары нуклеотидов (пн), то он обычно повторяется через 256 пн, при длине 5 пн - через 1024, 6 пн - через 4 096 пн, 7 пн - через 16 384 пн, 8 пн - через 65 536 пн. С учетом этого для получения фрагментов ДНК, по величине соизмеримых с генами, естественно, выбирают рестриктазы с редко встречаемыми сайтами узнавания нуклеотидных последовательностей.

Такой рестриктазой, в частности, является EcoRl, образование которой детерминируется в кишечной палочке плазмидой R1. Специфически распознаваемые ею нуклеотидные последовательности встречаются в молекулах ДНК не чаще, чем через 4000-16 000 пн. Следовательно, фрагмент ДНК, образующийся под действием EcoRl, может включать два и более генов (1 ген в среднем содержит 1000-1500 пн).

Полученные гены, однако, не всегда соответствуют функционирующим ввиду того, что сайты расщепления рестриктаз в исходных молекулах ДНК оказываются в их пределах. Это приводит к дроблению структурных генов или утрате ими регуляторных последовательностей. В подобных случаях выделенные гены подключают к промоторам или же прибегают к процедуре наращивания недостающих нуклеотидов.

Плохо функционирующий ген активируют дополнительными вставками аналогичных ему генов, что называют тандемной амплификацией (англ. tandem - один за другим, лат. amplificatio - увеличение), а к генам со сдвигом рамки считывания информации добавляют линкеры (англ. link - связующее звено), чтобы подстроить их под рамку считывания предшествующего гена или его фрагмента.

Успешное использование выделенного гена определяет прежде всего рецииентная клетка. Так, гены эукариот, в составе которых, как известно, имеются не содержащие информации интроны, не экспрессируются в клетках прокариот, так как в них не происходят процессинг и сплайсинг и к тому же недеятельными оказываются промоторы. Напротив, экспрессия генов прокариот в бактериях достигается без особых трудностей.

- Читать далее "Синтез генов. Передача и клонирование генов"