Иммунохимическое изучение антигенного комплекса. Антигены рака молочной железы

Анализ выделенного комплекса был проведен нами совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов и гликопротеипов Института биоорганической химии.
Углеводы в полученных препаратах определяли методом газожидкостной хроматографии в виде триметилсилильных производных метилгликозидов, образующихся после метанолиза (0,5 N НС1 в абсолютном метаноле, 100°С, 24 часа). В качестве внутреннего стандарта использовали D-маннит. Образцы анализировали на газовом хроматографе фирмы «Хыолет Паккард 5710 А» с пламенноионизированным детектором. Условия разделения: газ-носитель-азот, колонки 3 м/2,2 мм, стационарная фаза 1,5% SE — 30 и 1% ХЕ-30 на супелкопоре (100—200 меш), температура испарения и детектора 250°С. После ввода пробы колонка выдерживалась 10 минут при 140°С в изотермическом режиме, затем температура повышалась до 220°С со скоростью 1С/мин. Далее колонка выдерживалась в изотермическом режиме.

Сиаловые кислоты определяли по методу Уоррена.
Белок исследовали по Лоури, а также спектрофотометрически при 280 им, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Нуклеиновые кислоты определяли спектрофотометрически при 260 им.
Гель-хроматографию антигенного комплекса проводили на ссфарозе 4В (колонка 3X40 см) в 0,05 М натрийфосфатпом буфере, рН 6,0, содержащем 0,075 М NaCl и 0,1% азида натрия. Фракции собирали по 10 мл; фракции, содержащие идентичные вещества, объединяли, диализовали и лиофилизовали.

Электрофорез осуществляли в тонком слое 5 % -го полиакриламидного геля с 0,1% SDS в натрийфосфатпом буфере, рН 7,1, на пластинках 12,5X26 см на приборе «Мультифор» фирмы ЛКБ (Швеция). Образцы предварительно инкубировали в буфере с 1% 2-меркаптоэтанола и 1% SDS 2—3 мин при 100°С. На пластинку наносили по 10—50 мкг вещества. Белок проявляли раствором кумасси, углеводы — реактивом Шиффа. Для определения молекулярного веса использовали стандарты, коммерческие препараты фирмы Берингер (ФРГ): трипсиновый ингибитор (21500), РНК-полимеразу (р 165000, |3155000, а 390000), бычий сывороточный альбумин.

Десиалирование антигенного комплекса проводили 0,1 N H2S04 при 80°С в течение 1 часа, раствор охлаждали, диализовали и лиофилизовали.

антигенный комплекс

Проназный гидролиз. 3 мг антигенного комплекса инкубировали в 3 мл трис-HCl буфера, рН 7,5, с 1,2 мг пропазы в течение суток при 37°С. Добавляли еще 1,2 мг проназы и продолжали инкубировать сутки. Далее реакционную массу нейтрализовали и упаривали досуха. Проназу фирмы «Calbiochem» (США) предварительно инкубировали 3 часа в тех же условиях.
Иммунологическое изучение антигенного комплекса было начато с получения иммунных сывороток.

Антисыворотку к антигенам опухоли молочной железы получали путем иммунизации кроликов. Животных иммунизировали многократным введением полученного стерильного антигенного препарата: первоначально в лимфоузлы подколенной области, затем внутрикожно, внутримышечно и подкожно с применением полного адъюванта Фрейнда. Весь период иммунизации длился три месяца и состоял из трех циклов.
Для удаления антител к групповым антигенам крови антисыворотку последовательно адсорбировали смесью сухой плазмы доноров I, II, III групп крови из расчета 5 мг на 1 мл сыворотки.

Противотканевые тела из иммунных сывороток адсорбировали аналогичными антигенными комплексами, полученными из нормальных органов: печени, селезенки, легких, почек, мочевого пузыря, ткани молочной железы.
Адсорбцию проводили порошком антигенного комплекса из расчета 5—25 мг/мл сыворотки. В некоторых случаях использовали адсорбцию в геле, предложенную Бьсрклеидом. После адсорбции иммунную сыворотку проверяли на полноту истощения ( с более концентрированными антигенами).

Выделение глобулиновой фракции из истощенной и концентрированной сыворотки осуществляли осаждением сульфатом аммония при 50% насыщения.
Изучение антигенной активности и выяснение наличия специфичности выделенного комплекса проводили с помощью реакции преципитации в геле методом двойной диффузии по Оухтерлопп с использованием гетерологичных кроличьих сывороток.

Испытание антисыворотки к антигенному комплексу из ткани опухоли молочной железы проводили в тест-системе с образцами опухоли молочной железы и нормальных тканей печени, селезенки, почки и молочной железы. В тест-системе использованы аналогично приготовленные из тканей нормальных органов антигенные комплексы.

Выяснение наличия специфичности антигена проводили ингибицией реакции преципитации тест-системы, взятой в максимально пороговом разведении с другими антигенами, а также испытанием антнсыпороткн к антигену рака молочной железы с концентрированными антигенами. Титр систем составил 1 : 64— 1 : 128.
Материалом исследования служили 19 образцов раковой ткани молочной железы человека и 8 образцов нормальной и опухолевых тканей различных локализаций.

Применение горячей водно-фенольной экстракции (способ I) позволило выделить фракцию, составлявшую 0,1—0.2% от веса исходной высушенной ткани, а после очистки выход ее снижался до 0,01—0,03%. Эти данные согласуются с данными авторов, использующих указанный метод экстракции антигенного комплекса из опухолей других локализаций.

- Читать далее "Экстракция антигенов из рака молочной железы. Углеводы антигенов рака молочной железы"

Оглавление темы "Антигены и антитела при раке":
  1. Иммунохимическое изучение антигенного комплекса. Антигены рака молочной железы
  2. Экстракция антигенов из рака молочной железы. Углеводы антигенов рака молочной железы
  3. Гликопротеины рака молочной железы. Антигенный комплекс эмбриональной ткани
  4. Распространение опухолевого процесса. Иммунный ответ на метастазирование опухоли
  5. Реакция иммунитета на распространение опухоли. Реакция организма на эмбриональные антигены
  6. Кожные реакции на опухолеассоциированные антигены. Кожные реакции на эмбриональные антигены
  7. Гуморальный иммунитет при раке молочной железы. Клеточный иммунитет при раке
  8. Классификация опухолевого процесса. Распространение опухоли
  9. Кожная реакция на эмбриональный антиген. Реакция кожи на туберкулин
  10. Иммунитет после лечения рака молочной железы. Иммунитет при метастазировании рака

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: