Пероксидазно-антипероксидазная (ПАП) методика. Реакции с гликозил-оксидазой при опухолях

Методики связывания энзима (пероксидазы) принципиально сходны со способом флуорохромной метки антигена, как непрямым, так и прямым, только здесь антитело „несет" не флуорохром, а энзим. Однако, в отличие от непрямого метода Кунса, цепочка „первичных", так сказать, промежуточных антител, через которые осуществляется связь энзима с антигеном, здесь может быть и длиннее, и сложнее.

При так называемой методике моста антител энзимное, т. е. пероксидазное антитело связывается с „первичным" антителом (уже „сидящим" на антигене) посредством еще одного антитела, выполняющего роль мостика. Этот мостик как бы развернут боком к своим связуемым звеньям и связывает своими короткими иммуноглобулиновыми цепями их длинные цепи. Таким образом, имеется три слоя субстанций: антиген со связанным антителом в ткани, антитело-мост и антитело, несущее пару молекул пероксидазы.

При пероксидазно-антипероксидазной (ПАП) методике в третьем, т. е. наружном слое вместо антитела, связанного с пероксидазой, имеется пероксидазно-антипероксидазный (ПАП) комплекс [Van Noorden, Polak, 1983; Cordell et al., 1984; Sternberger, 1986; et al. ]. В этом комплексе молекулы энзима располагаются с двух сторон между двумя короткими цепями двух связанных и „несущих" энзим антител.
Концентрацию молекул пероксидазы на сайте антигена и, следовательно, чувствительность методики можно увеличивать, повторяя последовательности иммуноглобулинов при так называемых многоступенчатых реакциях [Denk, 1987].

пероксидазно-антипероксидазная методика

Для первичных моноклональных антител разработаны иммуногистохимические моноклональные ПАП-наборы [Cuell et al., 1984]. Поскольку моноклональные антитела распознают только один специфический тип антигенной детерминанты, моноклональные ПАП-комплексы имеют более низкие молекулярные веса, нежели поликлональные, и содержат, очевидно, лишь две молекулы пероксидазы хрена (на одну молекулу антитела), которые облегчают их проникновение.

Использование моноклональных ПАП-комплексов сопровождается интенсивным специфическим окрашиванием и очень слабым фоновым. В „гибридомной" иммуногистохимии применяются моноклональные антитела с двойной специфичностью, распознающие и пероксидазу, и другой антиген.

В ряде случаев выгоднее применять глюкозил-оксидазу, поскольку скажем, в молочной железе нет эндогенной энзимной активности [Gown et al., 1986]. В этом случае во избежание ложноположительных результатов при употреблении щелочной фосфатазы и пероксидазы их следует блокировать, соответственно, левамизолом, уксусной кислотой с перекисью метанола или периодатным окислением. Такие воздействия могут приводить к нарушению антигенных свойств субстратов в тканях.

Поэтому W. D. Kuhlmann, P. Peschke в 1986 г. предложили чувствительную методику, заключающуюся в комбинированном применении глюкозил-оксидазы и пероксидазы хрена, которые параллельно связываются на одной и той же плазмалемме или органелле клетки и действуют как компоненты одной последовательной реакции. Перекись водорода, образующаяся в ходе реакции с гликозил-оксидазой, является субстратом пероксидазы хрена и используется для окисления хромогенов. Эта методика лучше традиционной, с иммунопероксидазной меткой для выявления антигенов в тканях, богатых эндогенной пероксидазной активностью.

- Читать далее "Хромоген для пероксидазных методик. Иммуногистохимия с щелочной фосфатазой"

Оглавление темы "Иммуногистохимия опухоли":
  1. Абберации хромосом опухолевых клеток. Модальное число
  2. Гистограммы распределения ДНК в опухоли. Анэуплоидные опухолевые клетки
  3. Перидиплоидные стволовые линии опухоли. Тест ядрышковых организаторов опухолевых клеток
  4. Онкофетальные антигены. Канцеро-эмбриональный антиген
  5. Альфа-фетопротеин (АФП). Иммуногистохимические маркеры дифференцировки опухоли
  6. Основные принципы иммуногистохимии. Иммунофлуоресцентная (или иммунолюминесцентная) микроскопия
  7. Пероксидазно-антипероксидазная (ПАП) методика. Реакции с гликозил-оксидазой при опухолях
  8. Хромоген для пероксидазных методик. Иммуногистохимия с щелочной фосфатазой
  9. Коллоидальное золото в иммуногистохимии опухоли. Биотин-авидиновая иммуногистохимия
  10. Иммуногистохимия по методике меченого протеина А. Оценка кариотипа опухоли

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: