В опытах in vitro оценивали возможность необратимого ингибирования хлор-ионных каналов ГАМК-литиками. С этой целью отмытые синаптические мембраны коры больших полушарий интактных крыс-самцов инкубировали с ДСТА, норборнаном, пикротоксином и t-бутилбициклофосфатом (30 мин., при 0°С). Далее препараты мембран подвергали 5-кратному отмыванию с последующим центрифугированием. Плотность хлор-ионофоров оценивали с помощью специфического "маркера" 3Н-бутилбициклоортобензоата (5 нМ). В контрольный препарат мембран вносили эквивалентное количество растворителя (ДМСО). В последующем эти пробы обрабатывали как описано выше.

Специфическое связывание радио-лиганда при концентрациях норборнана 100 и 250 нМ составило, соответственно, 22 % и 18 % от исходного. Предварительная обработка мембран ядом в концентрациях 500 и 1000 нМ практически подавляла специфическое связывание лиганда (снижение на 93 % и 97%, соответственно). Кажущуюся концентрацию норборнана, вызывающую необратимое угнетение половины хлор-ионных каналов ГАМКа рецепторов рассчитывали с использованием регрессионного анализа методом наименьших квадратов. Эта величина составила 39 нМ. Она близка к значению ICso (см. выше).

Однако, это не идентичные величины. ICso определялась при одновременном инкубировании ингибитора и радиолиганда, в то время как концентрация норборнана, вызывающая необратимое угнетение половины хлор-ионофоров, оценивалась после удаления яда многократным отмыванием мембран.

В литературе подобное явление обозначается "алкилированием" либо "ацилированием". Термины не тождественны, однако в обоих случаях речь идет об образовании ковалентной связи между молекулой ГАМК-литика и каким-то участком хлор-ионофора.

Оценены временные характеристики ацилирования белка хлорионных каналов. С этой целью препараты мембран инкубировали в присутствии норборнана (100 нМ) 5 мин, 10 мин, 30 мин и 1 час. Пробы подвергали 5-кратному отмыванию - центрифугированию и определяли сохранившиеся места связывания 3Н-ТВОВ. Расчет кажущегося времени полуацилирования осуществляли с помощью регрессионного анализа методом наименьших квадратов. Это значение составило 28± 6 мин.

Результаты опытов по оценке связывания 3Н-ТВОВ после предварительной обработки синаптических мембран коры больших полушарий t-БЦФ, пикротоксином и дисульфотетраазаадамантаном представлены на рисунках 24 и 25. Видно, что прединкубация с t-БЦФ в концентрациях 100 нМ и менее не влияет на плотность мест связывания 3Н-ТВОВ. Аналогичные данные получены при использовании ДСТА и пикротоксина в диапазоне концентраций 100-10000 нМ.

Это позволяет заключить, что перечисленные ГАМК-литики обратимо связываются с белком хлор-ионофора и не относятся к ацилирующим агентам. Вместе с тем, при предварительной обработке мембран t-бутилбициклофосфатом в концентрациях 250 нМ, 500 нМ и 1000 нМ отмечалось достоверное снижение специфического связывания 3Н-ТВОВ (на 19 %, 33 % и 25 %, соответственно). По-видимому, это объясняется тем, что даже 5-кратное отмывание не обеспечивает полного удаления из инкубационной среды изучаемого агента. Как известно, t-БЦФ обладает высоким сродством к хлор-ионному каналу, поэтому даже в низких концентрациях он может тормозить связывание 3Н-ТВОВ.

- Читать далее "Радиолиганд и бициклофосфат. Радиолигандный анализ ГАМК рецепторов"