Методы диагностики фенилкетонурии

Методы диагностики фенилкетонурии - проявления

Фенилкетонурия (ФКУ) представляет собой основную парадигму из всех генетических нарушений, подлежащих скринингу у новорожденных. Она вызывается дефицитом фермента фенилаланингидроксилазы (ФАГ), ведущим к накоплению фенилаланина в крови и метаболитов фенилаланина в моче. В нелеченных случаях у больных развивается умственная отсталость и другие неврологические нарушения.

Частота фенилкетонурии в европейских странах подвержена определенным колебаниям от 1 : 6000 (Ирландия) до 1:13 000 (страны центральной и восточной Европы), в России - 1:7200.

В программах массового скрининга на ФКУ и другие дефекты обмена используются главным образом 3 метода:
1) микробиологический метод Гатри,
2) хроматография на бумаге или другом носителе (селикагель и др.),
3) флюорометрический метод (более чувствительный), основанный на образовании флюоресцирующего комплеса фенилаланина с лейцил-аланином.

В России наибольшее распространение получил флюорометрический метод с использованием аппаратов типа Флюороскан.Дельфия, многофункциональный аппарат «Victor» с компьютерным анализом полученных результатов.

В настоящее время все эти методы начинает замещать тандемная масс-спектрометрия. Это наиболее чувствительный и дающий меньше всего ложно-положительныхтестов на ФКУ метод в первые 24 ч жизни новорожденного. Метод является наиболее эффективным для раннего выявления наследственных заболеваний обмена веществ, однако в силу своей дороговизны, он применяется лишь в ряде развитых странах мира.

Микробиологический тест Гатри основан на принципе молекулярного антагонизма, когда микробный рост наблюдается только вокруг дисков, содержащих избыточные количества фенилаланина. Тест Гатри отличается простотой выполнения, дешев, для его проведения требуется 2 мкл крови. Метод легко поддается автоматизации может использоваться для детекции не только ФКУ, но и других аминоацидопатий.

Хроматографический метод основан на различном распределении аминокислот из крови между подвижной и неподвижной фазами. В процессе массового скрининга используют хроматографию на бумаге и в тонком слое селикагеля или целлюлозы. Материалом для исследования служит кровь, высушенная на бумаге, может также использоваться и моча или плазма, отделенная от форменных элементов с помощью центрифугирования.

Преимуществом хроматографии является возможность определения содержания, кроме фенилаланина, других аминокислот в исследуемом образце крови. Однако в связи со сложностью интерпретации при отсутствии предварительной обработки материала и трудоемкостью хроматографический метод не находит широкого распространения. Поэтому на практике более широко используется тонкослойная хроматография, которая является более быстрым и четким методом, но вместе с тем этот метод более дорогой и требует обязательной предварительной обработки исследуемого материала.

За последние годы для определения концентрации фенилаланина в крови большое распространение получил метод флюорометрии. Принцип метода состоит в том, то L-фенилаланин в присутствии L-лейцил-L-аланина образует с нингидрином флюоресцирующее соединение, интенсивность свечения которого можно измерить на спектрофотометре. Метод отличается высокой точностью, с его помощью можно дополнительно определять концентрацию тирозина в крови, что особенно важно при диагностике фенилкетонурии и при контроле за эффективностью лечения. Кроме того, метод легко поддается автоматизации. Недостатком метода является дороговизна оборудования и необходимость элюирования аминокислот из высушенных на бумаге образцов крови.

Важным является возраст детей в момент забора образцов. Еще 25 лет назад Хольтцман и соавт. установили низкий уровень фенилаланина в рано взятых образцах крови у детей с ФКУ. Они считали, что дети с ФКУ могут быть пропущены из-за низкого уровня фенилаланина в крови, взятой до 48 ч жизни ребенка. После того как было показано, что у детей с ФКУ уровень фенилаланина повышается уже в первые 24 часа жизни, что дает основание для пересмотра и расширения реальных возможностей скрининга с взятием крови на 24 часу жизни. В большинстве случаев в пробе крови, взятой у новорожденного на 4-5-й деньжизни на фильтровальную бумагу, определяется концентрация фенилаланина.

Образцы взятой крови отправляются в медико-генетические консультации или медико-генетические центры, где осуществляется определение концентрации фенилаланина в крови, взятой на фильтровальную бумагу. Основным биохимическим маркером ФКУ, выявляемым при использовании любых методов, является увеличение концентрации фенилаланина в крови более 120 мкМ/л (более 2 мг%).

Степень дефицита ФАГ определяет степень гиперфенилаланинемии(ГФА). Нормальный уровень фенилаланина (Фен) в крови менее 120 ммол/л. Уровень Фен в крови 1200 микромолль/л или больше относится к классической ФКУ и ассоциируется с принципиально не определяемой активностью ФАГ. Концентрация Фен от 600 до 1200 микромолль/л классифицируется как мягкая ФКУ, в то время как уровень от 180 до 600 микромолль/л указывает на мягкую гиперфенилаланинемию (ГФА).

Как мягкая ФКУ, так и мягкая ГФА ассоциируются с остаточной активностью ФАГ. Ограничение Фен в диете требуется для нормального или близкого к нормальному развития познавательных процессов при классической и мягкой ФКУ, в то время как при мягкой ГФА диетическое лечение не требуется (189). Ген ФАГ клонирован и картирован на хромосоме 12q24.1. В локусе ФАГ описано более 440 типов мутаций. Генотип и биохимический фенотип тесно коррелируют: нуль-мутации ассоциируются с классической ФКУ, другие - с мягкой ФКУ или мягкой ГФА. В то же время, вариабельность в биохимическом фенотипе была обнаружена для целого ряда мутаций.

Неонатальный скрининг начался с теста Гатри на ФКУ. До сих пор это наиболее распространенный метод идентификации ФКУ в неонатальном скрининге, хотя в ряде программ он был замещен количественным, более чувствительным флюорометрическим методом . Средний IQ оптимально леченныхдетей сходен с таковым в общей популяции. В то же время даже рано начавшие лечение и хорошо контролируемые больные с ФКУ могут иметь минимальные знаки неврологической недостаточности.

Наилучшие показатели развития достигаются тогда, когда диетическое лечение начато до 3 недель жизни, уровень фенилаланина контролируется на уровне 120-360 микромолль/л, а диета продолжается хотя бы в течение первых 10 лет, если не в течение всей жизни.

- Рекомендуем далее ознакомиться со статьей "Методы диагностики гиперфенилаланинемии (ГФА) - проявления"

Оглавление темы "Скрининг наследственных и врожденных заболеваний":