Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

При выборе ДНК-маркеров для метода ПДРФ очень большое значение имеет уровень их гетерозиготности в популяции. Распределение в популяции аллельных вариантов того или иного локуса является случайным, поэтому ожидаемый уровень гетерозиготности (и информативность) маркерного локуса прямо связан с числом часто встречающихся в популяции аллелей: чем больше таких аллелей, тем выше вероятность того, что данный индивидуум будет по этому локусу гетерозиготен. В сообщении Комитета по ДНК 9-го совещания по картированию генома человека даны рекомендации по расчету информационной емкости полиморфизма (polymorphic information content, PIC) исходя из частот аллельных вариантов. Локусы с PIC > 0,4 многоаллельны и обычно содержат варьирующее число тандемных повторов (VNTR-локусы). Некоторые из таких локусов образуют гаплотипы. Многие VNTR-локусы клонированы, и их можно использовать в качестве ПДРФ-маркеров. Не менее важен и выбор рестриктирующей эндонуклеазы. Наибольшую разрешающую способность обеспечивают рестриктазы Mspl и Taql. Достаточно часто используют и другие ферменты, например Pstl и Bglll. Иногда приходится применять более двух рестриктаз.

Обычный анализ ПДРФ состоит из двух этапов:
а) рестрикция ДНК и электрофорез в агарозном геле;
б) блот-гибридизация по Саузерну.
Вместо нитроцеллюлозных фильтров можно использовать найлоновые: переносить на них ДНК проще и быстрее. Кроме того, найлоновые фильтры прочнее нитроцеллюлозных и на них можно проводить повторные гибридизации. Если нуклеотидная последовательность полиморфного участка известна, то возможен и другой подход к анализу ПДРФ. Содержащий полиморфный сайт участок амплифицируют с помощью ПЦР и продукты амплифицикации обрабатывают соответствующей рестриктазой. Потерю или появление рестрикционного сайта определяют соответственно по наличию или отсутствию рестрицированного ПЦР-продукта. Этот метод можно применять и для анализа архивных препаратов.

Расщепление ДНК рестриктирующими эндонуклеазами и электрофорез в агарозном геле

Материалы
• 10 х рестриклионный буфер: 100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ и 0,5, 1,0 или 1,5 М NaCl
• Рестриктазы
• 10 х буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксилолцианол, 100 мМ ЭДТА, рН 8,0
• 10 х ТБЭ: 0,89 мкМ основный трис, 0,89 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА. рН доводят до 8,1-8,2 с помощью твердой борной кислоты

маркеры эндонуклеаз

• Агароза для электрофореза
• Буфер ТЭ
• Раствор бромистого этидия: 1000 х концентрированный раствор, 0,5 мг/мл, хранят в темноте
• Прибор для горизонтального гель-электрофореза

Методика
1. В микроцентрифужную пробирку вносят 20 мкл 10 х рестрикционного буфера, х мкл ДНК (30 мкг) и доводят объем дистиллированной стерильной водой до 180 мкл.
2. Добавляют рестриктазу из расчета 1—5 ЕД/мкг ДНК. При этом объем добавляемого фермента не должен превышать 1/10 конечного объема реакционной смеси.
3. Инкубируют смесь при рекомендованной температуре в течение ночи.
4. Рестрицированную ДНК очищают смесью фенол/хлороформ и переосаждают спиртом.

5. Осадок ДНК растворяют в ТЭ и определяют концентрацию ДНК.
6. К 10 мкг образца ДНК добавляют 3 мкл 10 х буфера для нанесения и доводят объем до 30 мкл с помощью ТЭ.
7. Наносят весь образец на агарозный гель и проводят электрофорез в 0,5 х ТВЭ.
8. Гель окрашивают бромистым этидием и просматривают его в УФ-свете.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: