Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов

Амплификацию генов в фиксированных формалином и залитых в парафин тканях можно выявить с помощью дот-блот-гибридизации. Проводя такую гибридизацию, необходимо быть уверенными в ее специфичности. При работе со свежими или замороженными тканями наилучшие результаты дает блот-гибридизация по Саузерну. Для выявления амплификации сравнивают с помощью денситометра интенсивности сигналов, получаемых при одновременной гибридизации равных количеств анализируемой ДНК с интересующим исследователя геном и с известным уникальным (например, глобиновым) геном или при последовательной гибридизации одного и того же фильтра с двумя этими зондами.

Материалы
• Образцы ДНК (из фиксированных формалином и залитых в парафин тканей)
• ТЭ/NaOH: 0,4 М NaOH в буфере ТЭ
• ДНК спермы лосося, обработанная ультразвуком
• 20 xSSPE
• 100 х раствор Денхардта

• 10 xSSC
• Предгибридизационный буфер
• 32Р-зонд, полученный с помощью концевого мечения или метода рассеянной затравки
• Нитроцеллюлозный фильтр
• Прибор для дот-блот-гибридизации

амплификации генов

Методика
1. Выделяют ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин тканей.
2. Растворяют 10 мкг ДНК в 50 мкл буфера ТЭ/NaOH.
3. Делают серийные разведения (например, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16) полученного раствора ДНК в буфере ТЭ/NaOH и доводят концентрацию ДНК во всех разведениях до 10 мкг в 50 мкл с помощью разведенной в том же буфере ДНК спермы лосося.
4. Инкубируют при 37 С 10 мин и добавляют 50 мкл ацетата аммония.
5. Вручную или с помощью прибора для дот-блот-гибридизации наносят ДНК на нитроцеллюлозный фильтр и прожаривают фильтр при 80 С под вакуумом в течение 2 ч.
6. Проводят предгибридизацию и гибридизацию с 32Р-зондом.

7. Отмывают фильтр при непрерывном покачивании в следующих растворах:
а) 0,1 х SSC, 0,1% ДСН, две смены по 15 мин при комнатной температуре;
б) 0,1 х SSC, 0,1 % ДСН, две смены по 30 мин при температуре 65 °С;
в) 0,1 xSSC, две смены по 10 мин при комнатной температуре.

8. Высушивают фильтр на воздухе и проводят радиоавтографию.
Рестриктирующая эндонуклеаза, узнающая специфические последовательности, расщепляет по ним ДНК с образованием фрагментов, длину которых можно определить с помощью электрофореза в агарозном геле. Размер рестрикционных фрагментов у разных лиц может различаться, например, вследствие замены одного или нескольких нуклеотидов, сопровождающейся потерей сайта рестрикции или, напротив, появлением нового сайта. Изменение размера фрагментов может происходить и в результате вставок или делеций протяженных участков ДНК.

В обоих случаях изменяется скорость перемещения рестрикционных фрагментов при гель-электрофорезе, и эти фрагменты легко идентифицировать с помощью блот-гибридизации по Саузерну с использованием меченого зонда, узнающего прилежащую к сайту рестрикции или сцепленную с ним последовательность. Метод анализа ПГ применяется при определении группы сцепления наследственных болезней и для выявления делеций определенных генов в опухолевых клетках. При этом можно работать с ДНК, вьшеленной как из свежих тканей, так и из архивных препаратов.

- Читать далее "Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: