Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP

В этом случае анализируемую последовательность амплифицируют и одновременно метят с помощью ПЦР, используя меченые праймеры или нуклеотиды. Если длина амплифицированного фрагмента не превышает 200 нуклеотидов, то большинство точковых мутаций (например, мутаций в гене ras) можно выявить по изменению скорости движения фрагмента при гель-электрофорезе с помощью анализа SSCP. И хотя этот метод не позволяет точно определить ни локализацию, ни характер мутации, он достаточно прост, не занимает много времени и обладает высокой эффективностью, что делает его очень полезным при скрининге точковых мутаций. Если мутация выявлена, то для определения ее характера и локализации можно использовать другие методы, например прямое секвенирование.

Материалы
• Образец ДНК: 50 нг/мкл
• 10 х полинуклеотидкиназный буфер: 500 мМ трис-HCl, рН 8,3, 100мММвС12,50мМДТТ
• Полинуклеотидкиназа (ПК): 10 ЕД/мкл
• Р-АТР: 160 мКи/мл, 700 Ки/ммоль
• 10 х буфер для ПЦР: 200 мМ трис-HCl, рН 8,3, 500 мМ КС1, 20 мМ MgCl2, 1 мг/мл БСА
• Смесь dNTP: по 1,25 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP

• ДНК-полимераза Taq. 5000 ЕД/мл (фирмы Perkin— Elmer Cetus)
• Праймеры в концентрации 10 мкМ каждый
• Краситель с формамидом: 95% формамид, 10 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол
• Раствор акриламида: 49% акриламид, 1% N,N-метиленбис-акриламид
• 10 х ТВЭ: 0,5 М основный трис, 0,5 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА
• Термоциклер (например, Cetus или Pharmacia GeneA-TAQ)
• Прибор для гель-электрофореза

одноцепочечный полиморфизм

Методика 1. Готовят смесь следующего состава и инкубируют ее 30 мин:
• Вода 1 мкл
• Праймеры по 1 мкл каждого
• 10 х ПК-буфер 0,5 мкл
• Р-АТР 1 мкл
• Полинуклеотидкиназа 0,5 мкл

2. Добавляют 255 мкл воды, 40 мкл 10 х буфера для ПЦР и 20 мкл смеси dNTP.
3. Из полученной смеси отбирают 80 мкл и добавляют 0,5 мкл ДНК-полимеразы Taq.
4. Из этой смеси переносят 4 мкл в пробирку на 0,5 мл, добавляют 1 мкл ДНК, перемешивают и наслаивают несколько капель минерального масла.
5. Прогревают пробирку при 94 С 1 мин и проводят 30 циклов амплификации (денатурация: 94 °С, 20 с; отжиг и элонгация: 60 или 65 °С, 2 мин).
6. Добавляют в пробирку 45 мкл красителя с формамидом и центрифугируют ее при 12 000 g 2 мин.

7. Собирают прибор для гель-электрофореза и заливают гель следующего состава:
• 10хТБЭ 1,5 мл
• 50% глицерин 3,0 мл
• Раствор акриламида 3,0 мл
• 1,6% персульфат аммония 1,0 мл
• Вода 21,5 мл
• TEMED 30 мкл

8. Прогревают амплифицированную ДНК в красителе с формамидом при 80 С 5 мин и вносят в лунку I мкл образца.
9. Проводят электрофорез с охлаждением при постоянной мощности 40 Вт до тех пор, пока ксилолцианол не дойдет до уровня, отстоящего от конца геля на 5 см.
10. Гель высушивают и проводят радиоавтографию.

- Читать далее "Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: