Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций

На втором этапе аллель-специфичной гибридизации ДНК иммобилизуют на фильтре и гибридизуют с олигонуклеотидным зондом, охватывающим участок с предполагаемой мутацией. Обычно используют зонды с радиоактивно меченными концами.

А. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозном фильтре
Материалы
• Образцы ДНК
• 1 М NaOH
• Буфер ТЭ
• 2 М ацетат аммония
• Нитроцеллюлозные фильтры (ВА85, Schleicher & Schuell)
• Прибор для дот-блот-гибридизации (например, Manifold-II, Schleicher & Schuell; Bio-Dot SF, Bio-Rad)

Методика 1.10 мкг ДНК растворяют в 50 мкл 0,4 М NaOH, приготовленной на ТЭ-буфе ре.
2. Инкубируют раствор при 37 С 10 мин и нейтрализуют его равным объемом 2 М ацетата аммония.
3. Вручную или с помощью прибора для дот-блот-гибридизации наносят ДНК на нитроцеллюлозный фильтр.
4. Прожаривают фильтр при 80 °С под вакуумом в течение 2 ч.

дот-блот-гибридизация

Б. Гибридизация
Материалы
• 20 х SSPE: 3 М NaCl, 200 мМ NaH2P04, 50 мМ ЭДТА, рН 7,4
• 100 х раствор Денхардта: 2% (в/о) фиколл, 2% (в/о) поливинилпирролидон, 2% (в/о) БСА (фракция 5). Раствор готовят на стерильной дистиллированной воде
• 10 х SSC
• Буфер для отмывания: 3 М тетраметиламмонийхлорид, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, мМ ЭДТА, 0,1% ДСН
• 10% ДСН
• 32Р-зонд

Методика 1. Проводят предгибридизацию при 65 С в течение 2 ч в буфере следующего состава: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, 5% ДСН. 2. Добавляют 32Р-зонд (1 — 1,5 мкМ).

3. Проводят гибридизацию при 65 "С в течение 6 ч (или в течение ночи).

4. При непрерывном покачивании отмывают фильтр в следующих растворах:
а) 5 х SSC: две смены по 15 мин при комнатной температуре;
б) буфер для отмывания: 20 мин при 61 С;
в) 5 х SSC: 10 мин при комнатной температуре.

5. Высушивают фильтр на воздухе и проводят радиоавтографию.
Эффективность гибридизации и стабильность гибридов зависят как от искомой последовательности, так и от размера зонда (олигонуклеотида); оптимальные условия отмывания для каждого зонда подбирают опытным путем. В каждом эксперименте в число образцов включают мутантную и немутантную ДНК и Проводят гибридизацию с зондами, комплементарными как последовательности дикого типа, так и последовательности, несущей мутацию.

- Читать далее "Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: