Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР

ДНК можно выделять из фиксированных в формалине, залитых в парафин тканей, подготовленных для обычных гистологических исследований. Под действием формальдегида в ДНК образуются шиффовы основания, а между ДНК и белками — сшивки. В водных растворах оба этих процесса обратимы, поэтому ДНК можно выделить из фиксированных формалином тканей. Такая ДНК не является в полной мере интактной, но она находится в двухцепочечной форме, ее можно рестрицировать, гибридизовать с мечеными зондами и амплифицироватьс помощью ПЦР. Однако лучше все-таки выделять ДНК из свежих или замороженных тканей, поскольку получаемые при этом препараты более пригодны для большинства стандартных молекулярно-генетических методов.

Выделение ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин препаратов тканей

Материалы
• 10 х SSC: 1,5 М NaCl, 0,15 М цитрат натрия; рН доводят до 7,0 с помощью 1 М НС1
• Протеиназа К: 10 мг/мл в стерильной дистиллированной воде
• Смесь фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:24:1)
• 3 М ацетат натрия, рН 5,2
• Охлажденный спирт
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА

Методика
1. С помощью микротома получают 5—10 срезов толщиной 20 мкм.
2. Срезы депарафинируют так же, как при изготовлении обычных гистологических препаратов. Для этого их инкубируют по 10 мин в трех сменах ксилола, 100% этанола, 70% этанола и воды, а затем ополаскивают 1 х SSC.
3. С помощью стерильного скальпеля или бритвы вырезают нужный кусочек.
4. Помещают его в 3 мл раствора, полученного смешиванием 2470 мкл 1 х SSC, 500 мкл 10% ДСН и 30 мкл протеиназы К (10 мг/мл), и инкубируют при 37 С в течение 5-10 сут. Каждые 2—3 сут добавляют новые аликвоты протеиназы К.
5. Экстрагируют белки смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:24:1).
6. Осаждают ДНК охлажденным спиртом и полученный осадок растворяют в 200 мкл ТЭ.
- Нельзя выделять ДНК из блоков с признаками некроза или аутолиза: неудачи с получением более или менее интактной ДНК чаше всего связаны с неправильной фиксацией тканей.

выделение днк

Амплификация ДНК с помощью ПЦР

Основные принципы ПЦР были подробно рассмотрены и далее мы остановимся на методе амплификации ДНК из опухолевых клеток, предшествующей аллель-специфичной гибридизации. К сожалению, абсолютно надежного способа подбора высокоэффективных праймеров для амплификации не существует, но все же полезно учитывать следующее.
• GC-содержание в праймерах должно быть близко к 50%, а распределение нуклеотидов — случайным.
• Необходимо использовать праймеры, не образующие вторичную структуру. Вероятность образования такой структуры можно оценить с помошью компьютерных программ Squiggles или Circles.
• Необходимо проверить взаимную комплементарность праймеров и не использовать те из них, у которых комплементарны З'-концевые последовательности. Это уменьшит вероятность димеризации праймеров в процессе амплификации.

Материалы
• 10 х буфер для ПЦР: 500 мМ КС1, 100 мМ трис-HCl, рН 8,3, 15 мМ MgCI2, 0,1% (в/о) желатина
• 10 х смесь dNTP: по 2 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP
• ДНК-полимераза Tag: 5000 ЕД/мл (Perkin—Elmer Cetus)
• Геномная ДНК: 250-500 нг
• 10 x праймер 1:10 мкМ в буфере ТЭ
• 10 х праймер 2:10 мкМ в буфере ТЭ

Методика
1. В стерильную эппендорфовскую пробирку вносят по 10 мкл 10 х буфера для ПЦР, 10 х смеси dNTP, 10 х праймера 1, 10 х праймера 2, образец ДНК; доводят объем стерильной дистиллированной водой до 100 мкл.
2. Денатурируют ДНК прогреванием при 90-95 С в течение 10 мин.
3. Добавляют 2,5 ЕД (0,5 мкл) ДНК-полимеразы Taq, тщательно перемешивают и наслаивают несколько капель вазелинового масла.
4. Проводят 30-35 циклов амплификации.
5. Из реакционной смеси отбирают аликвоту и анализируют результаты амплификации с помощью электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием.
- При амплификации ДНК, полученной из фиксированных формалином и депарафинированных тканей, иногда приходится увеличивать число циклов до 50. Возможно, это связано с апуринизацией ДНК под действием формалина.

- Читать далее "Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: