Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром

Поскольку в результате ПЦР образуется большое количество ДНК, анализ ПДАФ можно проводить непосредственно, без гибридизации по Саузерну с радиоактивно меченным зондом. При этом интерпретация результатов не составляет труда, не занимает много времени и легко поддается стандартизации, поскольку не нужно, как в случае ПДРФ, точно определять длину фрагментов ДНК. Вместо этого параллельно с исследуемым образцом анализируют смесь всех возможных аллельных вариантов данного локуса. Генетический профиль индивидуума определяют, проводя сравнение со стандартной смесью аллельных вариантов.

При амплификации локуса D1S80 размер амплифицированных фрагментов варьирует от 375 до 850 п.н. при длине повтора только 16 п.н. Для хорошего разделения аллелей, различающихся только на один повтор, мы используем 6% полиакриламидный гель толщиной 0,75 мм и длиной 24 см. Гель формируют на пленке Gel Bond, облегчающей манипуляции с ним во время окрашивания (см. рекомендации фирмы-производителя). Полимеризация должна идти не менее 1—1,5 ч. Затем из геля вынимают гребенку и трижды промывают лунки 1 х ТВЭ. Вносят в лунки по 15—20 мкл ПЦР-амплифицированной ДНК и аккуратно заполняют их доверху 1 х ТВЭ. По обе стороны от набора образцов амплифицированной ДНК наносят растворенный в 1 х буфере для полимеразы Taq маркер с аллелями разного размера, например в следующем порядке:

Обычно утром готовят образцы ДНК, днем проводят амплификацию, на ночь ставят электрофорез при постоянном напряжении 110 В, а на следующий день проводят окрашивание серебром.

Окрашивание полиакриламидных гелей серебром

Материалы
• 1 % (о/о) азотная кислота
• 0,012 М нитрат серебра
• 37% формальдегид
• 37% (о/о) уксусная кислота
• Проявитель: 0,28 М углекислый натрий

пцр продукты

Методика
1. Разбирают камеру для электрофореза и фиксированный на Gel Bond гель помещают (пленкой вниз) на стекло. Для окрашивания берут по 350 мл каждого раствора и выполняют все операции в шейкере при интенсивном покачивании. Если гель был залит без использования пленки Gel Bond, то его при окрашивании нельзя сильно встряхивать.
2. Заливают гель на 10 мин 10% спиртом, затем спирт сливают.
3. Заливают гель 1% азотной кислотой на 6 мин, затем кислоту сливают.

4. Ополаскивают гель дистиллированной водой, затем промывают его в воде при интенсивном встряхивании в течение 5 мин.
5. На 40 мин заливают гель раствором нитрата серебра, затем раствор сливают.
6. Дважды при интенсивном встряхивании промывают гель водой.
7. К 350 мл охлажденного до 4 С проявителя добавляют 175 мкл формальдегида. Таким охлажденным раствором заливают гель и покачивают его до тех пор, пока не будут отчетливо видны окрашенные фрагменты. Затем проявитель сливают.

8. Чтобы остановить проявление, гель помещают на 5 мин в 10% уксусную кислоту, затем кислоту сливают.
9. Промывают гель в дистиллированной воде в течение как минимум 5 мин.
10. После окрашивания гель можно сушить на воздухе (если он был залит на пленке Gel Bond) или с помощью вакуумной сушки для гелей на фильтровальной бумаге ватман или пористом целлофане (фирмы Hoefer Scientific).

- Читать далее "Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: