ПЦР — это метод синтеза нуклеиновых кислот in vitro, в ходе которого происходит многократная репликация определенного участка ДНК. Специфичность ПЦР определяется подбором олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный для амплификации VNTR-локус. Эти праймеры гибридизуются с разными цепями ДНК в окрестности VNTR и ориентированы друг относительно друга таким образом, что амплифицируется участок ДНК, расположенный между ними. В протоколе описан метод амплификации локуса D1S80.

При установлении отцовства образцы крови матери, ребенка и предполагаемого отца подготавливают так, как это описано в протоколе, и полученную ДНК вносят в пробирки с реакционной смесью для ПЦР. Все пробирки помешают в термоциклер. Описанные в протоколе 20.2 состав реакционной смеси для проведения ПЦР и условия амплификации оптимизированы для термоциклера модели 480 фирмы Perkin—Elmer, и если применяются другие модели, их, возможно, придется модифицировать. Вначале реакционную смесь нагревают до примерно 95 С, чтобы денатурировать двухцепочечные молекулы ДНК; затем температуру понижают до уровня, при котором происходит отжиг праймера на фланкирующих VNTR-локус последовательностях.

На последнем этапе цикла температуру повышают до 72 °С; в этих условиях полимераза Tag присоединяет нуклеотиды к 3 -концам праймеров, и в результате образуется последовательность, идентичная VNTR. За каждый цикл ПЦР, состоящий из этапов денатурации, отжига праймера и элонгации, происходит удвоение числа последовательности-мишени, образовавшейся в предыдущем цикле, так что амплифицированные фрагменты ДНК матери, ребенка и предполагаемого отца не составляет труда выявить с помошью гель-электрофореза и окрашивания серебром.

Для выделения ДНК и проведения ПЦР необходимо использовать разные комплекты перчаток и лабораторной одежды. Сами эти процедуры должны проводиться в отдельных закрытых боксах, а анализ продуктов амплификации — в специальном помещении. На всех этапах необходимо использовать поршневые микропипетки с соответствующими наконечниками или наконечники с фильтрами фирмы Continental Products.

Амплификация локуса D1S80

Материалы
• Реакционная смесь
• Полимераза Taq (Perkin—Elmer Cetus # 8010046)
• 5 x буфер для нанесения с сахарозой: 60% (в/о) сахароза, 0,25% ксилолцианол, 0,25% бромфеноловый синий

Методика
• За 30 мин до начала работы включают термоциклер
• За 10 мин до начала работы нагревают термоциклер до 95 °С
1. В пробирки для амплификации вносят по 30 мкл стерильной дистиллированной воды. Параллельно каждой реакции ставят опыты с отрицательным контролем (вода) и положительным (известная ДНК).
2. В пробирки для амплификации вносят по 20 мкл ДНК, выделенной, как описано в протоколе, или по 300 нг очищенной ДНК, растворенной в 20 мкл. В пробирку с отрицательным контролем добавляют 20 мкл стерильной дистиллированной воды.
3. Размораживают 2 х реакционную смесь для амплификации, добавляют по 5 ЕД полимеразы Taq на каждые 50 мкл смеси и тщательно перемешивают.

4. К каждому образцу ДНК, а также к положительному и отрицательному контролям добавляют 50 мкл 2 х реакционной смеси.
5. Центрифугируют каждую пробирку при 12 000 g на микроцентрифуге 5 с и помещают пробирки в термоциклер.
6. Прогревают образцы при 95 С 5 мин и проводят 25 циклов амплификации. Каждый цикл состоит из отжига праймера (65 °С, 1 мин), элонгации (72 °С, 1 мин) и денатурации (95 С, 1 мин). По окончании последнего цикла пробирки медленно охлаждают до 50 °С со скоростью 1 С в секунду, после чего быстро охлаждают до 4 С и оставляют при этой температуре.

7. Центрифугируют пробирки при 12 000 g 5 с на микроцентрифуге и хранят ПЦР-продукты при -20 °С.
8. Из каждой пробирки отбирают 20 мкл и вносят их в пробирку с 5 мкл 5 х буфера для нанесения.
9. При анализе смеси амплифицированных ДНК ребенка и предполагаемого отца добавляют в пробирки с 5 мкл 5 х буфера для нанесения по 10 мкл соответствующих ДНК.

- Читать далее "Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром"