Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности

Ранее для выявления и характеристики VNTR-локусов применяли метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), Чтобы провести такой анализ, необходимо выделить из образца ДНК, очистить ее, обработать рестриктирующими эндонуклеазами, осуществить гель-электрофорез, перенести ДНК с геля на найлоновый фильтр, провести блот-гибридизацию ДНК с радиоактивно меченным зондом, содержащим нужную VNTR-последовательность, и радиавтографию. В результате на идентификацию личности с помощью ПДРФ уходит от 5 до 10 дней.

Недавно для выявления VNTR-локусов был предложен другой метод, основанный на применении полимеразной цепной реакции. Как и в случае ПДРФ, для проведения ПЦР прежде всего выделяют ДНК. Но затем вместо рестрикции ДНК проводят ее ПЦР-амплификацию, чтобы получить миллионы копий локуса ДНК, содержащего VNTR-последовательность. ПЦР-продукты можно быстро проанализировать с помощью гельэлектрофореза в полиакриламидном геле и окрашивания солями серебра. Такой способ исследования VNTR-локусов получил название метола полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ); в данных статьях мы рассмотрим его применение для изучения полиморфизма локуса D1S80 с целью установления отцовства.

Для проведения ПДАФ-анализа необходимо следующее оборудование.
• Ротатор для лабораторных пробирок (Fisher Sci).
• Ми кро центрифуга.
• Боксы для подготовки образцов и проведения амплификации (например, бокс для культур тканей Labconco, Fisher Sci).
• Термостаты.

• Нагревательная ячейка.
• Центрифужные пробирки на 2 мл с завинчивающимися крышками.
• Пробирки для амплификации Perkin—Elmer Cetus Gene Amplification Tubes или пробирки с завинчивающимися крышками на 0,5 мл Contitental Products.
• Поршневые микропипетки с соответствующими наконечниками и микродозаторы типа Rainin с наконечниками с ART-фильтрами Contitental Products.
• Термоциклер (например, модель 480 фирмы Perkin—Elmer).

идентификация личности

• Прибор для вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (Hoefer, SE 410-24 см).
• Источник питания для этого прибора, дающий постоянное напряжение до 250 В (например, Hoefer PS250).
• Качалка (New Brunswick Sci. Co, Gyrator shaker, модель G-2; можно приобрести в фирме Fisher Scientific).

Выделение ДНК для идентификации личности

Для выделения ДНК из цельной крови или из засохших пятен крови используют различные методы. Любой из них включает лизис клеток с высвобождением ядерной ДНК и очистку ДНК от используемых для амплификации ДНК-полимераз. Очень важно исключить попадание в препараты нуклеаз и ДНК от экспериментатора, а также продуктов предшествующих ПЦР-амплификаций или других препаратов ДНК; их источниками могут быть загрязненные реактивы и оборудование (особенно автоматические микропипетки). В связи с этим всю работу по выделению ДНК необходимо проводить в перчатках и — там, где это возможно, — использовать автоклавированные растворы и лабораторную посуду. Лучше всего физически разделить процессы выделения ДНК и анализа ПЦР-продуктов и использовать только специально предназначенное для этого оборудование.
Быстрое выделение ДНК из цельной крови или засохших пятен крови с использованием смолы Chelex

1. В центрифужную пробирку на 2 мл вносят 1 мл стерильной дистиллированной воды и добавляют 5 мкл крови или 3 мм2 материала с засохшей кровью. Тщательно перемешивают.
2. Инкубируют при тщательном перемешивании 20 мин при комнатной температуре (лучше всего использовать ротатор для центрифужных пробирок).
3. Центрифугируют при 10 000 g 3 мин и удаляют супернатант, оставляя (чтобы не взмутить осадок клеток или ткань) 20-30 мкл.
4. Добавляют 5% раствор Chelex до конечного объема 200 мкл (Chelex в натриевой форме, 100—200 меш, Bio-Rad, 5% раствор в стерильной дистиллированной воде). Перед добавлением смолу перемешивают до гомогенного состояния пипеткой с широким отверстием (например, наконечником от микропипетки P1000).

5. Инкубируют при 56 *С 30 мин и встряхивают в течение 10 с.
6. Кипятят образец 8 мин, встряхивают в течение 10 с и центрифугируют при 10 000 g 3 мин.
7. Для каждой ПЦР берут из полученного супернатанта 20 мкл.

- Читать далее "Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: