Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов

1. Вымачивают найлоновые фильтры с диаметром пор 0,45 мкм (BioDyne В, New York, USA) в дистиллированной воде в течение 20-30 мин. Маркируют фильтр, сделав надрез на одном из углов, и помешают его в аппарат для дот-блот-гибридизации (например, Bio-dot, Bio-Rad, California, USA). Убеждаются в отсутствии на фильтре пузырьков воздуха.
2. Нумеруют нужное количество пробирок для проведения ПЦР, в том числе пробирку для контроля1*. В каждую из них наливают 95 мкл свежеприготовленного раствора для денатурации.
3. Добавляют по 5 мкл раствора с ПЦР-продуктом, перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре, чтобы произошла денатурация продуктов амплификации.

4. Вносят в каждую ячейку аппарата для дот-блот-гибридизации 100 мкл раствора для денатурации и аккуратно фильтруют его через фильтры под вакуумом, не допуская полного высыхания ячеек.
5. В соответствующие ячейки вносят по 100 мкл раствора с денатурированным ПЦР-продуктом, не допуская образования в ячейках воздушных пузырьков.
6. Подсоединяют аппарат к вакууму и отсасывают раствор. Удаляют все пузырьки чистой пипеткой, чтобы раствор беспрепятственно проходил через фильтры. Отключают вакуум.
7. В каждую ячейку добавляют 200 мкл 20 х SSC. Фильтруют этот раствор через мембраны под вакуумом.

анализ пцр продуктов

8. Отключают вакуумный насос и открывают аппарат. Цветным карандашом помечают фильтры с нанесенными на них образцами. Пинцетом с тупыми концами переносят фильтры на лист фильтровальной бумаги ватман 3 ММ, пропитанной 2 х SSPE.
9. «Пришивают» ДНК к фильтру с помощью УФ-лампы (например, Stratalinker, Stratagene, Inc.)
10. Промывают фильтры в 2 х SSPE и, если не предполагается сразу же проводить гибридизацию, запаивают их в пластиковых мешочках с 20 мл 2 х SSPE.
11. Прогревают гибридизапионный буфер и раствор для промывания блотов в водяной бане при 65 С.

12. Помещают фильтр в пластиковый мешочек, содержащий 20 мл прогретого буфера, и запаивают мешочек. В один мешочек можно поместить сразу два фильтра, сложив их тыльными сторонами.
13. Инкубируют мешочки с фильтрами в водяной бане при 65 °С не менее 30 мин. При таком прогревании блокируются места неспецифического связывания зонда.
14. Срезают один из углов мешочка и сливают раствор. Добавляют столько же свежеприготовленного прогретого гибридизационного буфера, содержащего 32Р-зонд в концентрации 1 пмоль/мл (5,0*105-1,0*106 имп./мин на 1 пмоль). По возможности удаляют из мешочка все воздушные пузырьки, запаивают его и инкубируют при 60 °С 2 ч.

15. Вынимают фильтр из мешочка и аккуратно промокают его. Быстро споласкивают его в растворе для промывания блотов при комнатной температуре, а затем промывают при 60 °С в прогретом при 15 °С растворе.
16. Помещают фильтр на лист фильтровальной бумаги ватман 3 ММ и высушивают при комнатной температуре или при 37 С в течение 1 ч.
17. Заворачивают фильтр в тонкую пленку и экспонируют при —70 °С в кассете с рентгеновской пленкой с усиливающим экраном (гл. 14). Проявляют пленку, как обычно. Время экспозиции зависит от удельной радиоактивности зонда и качества гибридизации между зондом и мишенью.

- В качестве альтернативы можно использовать микротитровальную плашку с 96 ячейками.
- Если нет подходящего источника УФ-света или используются нитроцеллюлозные фильтры, то можно запечь мембрану под вакуумом при 80 °С в течение 1-2 ч.

- Читать далее "Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности"

Оглавление темы "Идентификация личности. Выявление мутаций":
1. Анализ ПЦР-продуктов с помощью дот-блот-гибридизации с 32Р-зондами. Техника анализа ПЦР продуктов
2. Идентификация личности. Выделение ДНК для идентификации личности
3. Амплификация локуса D1S80. Техника амплификации локуса D1S80
4. Анализ ПЦР-продуктов. Окрашивание полиакриламидных гелей серебром
5. Интерпретация результатов идентификации личности. Выявление точковых мутаций
6. Выделение ДНК с точковыми мутациями. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
7. Дот-блот-гибридизация для выявления мутаций. Техника дот-блот-гибридизации при выявлении мутаций
8. Анализ одноцепочечного конформационного полиморфизма. Методика и техника SSCP
9. Выявление амплификации генов. Техника выявления амплификации генов
10. Выбор маркеров и рестриктирующих эндонуклеаз. Анализ ПДРФ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: