Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов

Для нерадиоактивного мечения зондов используют несколько разных молекул-свидетелей, но, по-видимому, наиболее распространенной меткой является биотин, В протоколе описан способ детекции биотинилированных зондов, но этот же метод с незначительными модификациями подходит и в случае других молекул-свидетелей. В принципе нерадиоактивный и радиоактивный способы мечения обеспечивают одинаковую чувствительность детекции, однако технически первый из них более сложный. Это связано со следующими факторами.

а. При нерадиоактивном мечении чувствительность детекции очень сильно зависит от уровня включения молекулы-свидетеля в зонд. Если он повышается, то сигнал усиливается, но одновременно снижается эффективность гибридизации зонда с мишенью. При понижении уровня включения наблюдается обратная картина. Таким образом, оптимальный уровень включения необходимо подбирать опытным путем, но обычно он составляет примерно 30%.

б. Используемые при детекции нерадиоактивных меток реактивы нестойки, что может приводить к уменьшению чувствительности детекции, повышению фона и появлению неспецифического окрашивания. Эту проблему, впрочем, можно решить, если использовать имеющиеся сейчас в продаже высококачественные реактивы.

в. Поскольку время, в течение которого протекает ферментативная реакиня, не превышает 24 ч, увеличение времени инкубации в растворе субстрата не ведет к усилению сигнала, но зато повышает фон. Таким образом, в отличие от изотопно меченных зондов чувствительность детекции нерадиоактивных зондов ограничивается временем протекания ферментативной реакции.

Выявление биотинилированных зондов

Материалы
• Буфер 10 х HTM: 1 M NaCl, 1 М трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ MgCl2
• Блокирующий раствор
• Для нитроцеллюлозных фильтров: 0,5% (о/о) твин-20 в IxHTM
• Для найлоновых фильтров: 0,5% (о/о) твин-20, 1% обезжиренное сухое молоко или 0,5% (в/о) казеин в 1 х НТМ

меченные зонды

• Инкубационный буфер: 0,05% (о/о) твин-20 в I x НТМ
• Конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой (Dakopatts)
• Нитросиний тетразолий (НСТ): 75 мг/мл в 70% диметилформамиде (ДМФ)
• 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (БХИФ): 50 мг/мл в ДМФ
• Буфер для отмывания: 0,5% (о/о) твин-20 в 1 х НТМ
• Субстратный буфер: 0,1 М трис-HCl, рН 9,5, 0,1 М NaCI, 10 MM MgCl2,0,l MM ZnCl2

Методика
1. Отмыв фильтр после гибридизации, ополаскивают его несколько раз в блокирующем растворе и выдерживают в этом растворе в течение 60 мин при комнатной температуре.
2. Выдерживают фильтр в растворе с детектирующими реагентами в оптимальной концентрации при температуре 22—37 С в течение 10—30 мин; точное время и температура инкубации определяются тем, какие реактивы используются. В случае биотинилированных зондов инкубацию лучше всего проводить в растворе стрептавидин/шелочная фосфатаза в течение 10 мин при комнатной температуре. При работе со всеми реактивами необходимо точно выполнять установленные фирмой-производителем условия хранения и использования детектирующих реактивов.
3. Промывают фильтр в трех сменах буфера для отмывания, по 5 мин в каждой смене, и в двух сменах субстратного буфера, по 5 мин в каждой смене.

4. Готовят свежий раствор субстрата для колориметрического определения щелочной фосфатазы, для чего к 10 мл субстратного буфера добавляют 44 мкл НСТ и 33 мкл БХИФ. В этом растворе инкубируют фильтр в темноте в пластиковой чашке Петри в течение 16—20 ч.
5. После появления окраски тщательно промывают фильтр в воде.

- Концентрации детектирующих реактивов подбирают опытным путем. Обычно в случае биотинилированных зондов оптимальное разведение стрептавидина/щелочной фосфатазы в инкубационном буфере 1:250-1:10 000.

- Щелочную фосфатазу можно определить также с помощью хемилюминисцентных методов. Для этого фильтр после гибридизации помещают в пластиковый пакете субстратным буфером, содержащим 0,25 мМ 4-метокси-4-(3-фосфатфенил)спиро[1,2-диоксэтан-3,2-адамантан] (Sigma); на 100 см2 фильтра используется 1 мл этого буфера. Из пакета выдавливают пузырьки воздуха и запаивают его. Испускаемые при хемилюминисценции фотоны можно зарегистрировать с помощью рентгеновской пленки (как в случае радиоавтографии). Время экспозиции зависит от содержания молекул-мишеней и варьирует от 30 мин до 3 Ч.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Гибридизация ДНК и РНК":
1. Мечение 3'-концов. 3-концевое мечение с использованием терминальной лезоксинуклеотидилтрансферазы
2. Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов
3. Гибридизация нуклеиновых кислот. Принципы гибридизации нуклеиновых кислот
4. Блот-гибридизация нуклеиновых кислот. Блот-гибридизация ДНК
5. Изготовление дот-блотов ДНК. Техника блот-гибридизации ДНК
6. Блот-гибридизация РНК. Изготовление Нозерн-блотов с РНК денатурированной глиоксалем/ДМСО
7. Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов
8. Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК
9. Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов
10. Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: