Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов

Материалы
• Кассета для радиоавтографии
• Рентгеновская пленка (Kodak X-Omat AR или ее аналоги)
• Усиливающие экраны (DuPont Cronex Lightning-Plus или их аналоги)

Методика
1. После гибридизации слегка промокают фильтр и заворачивают его в пластиковую пленку. Особенно важно сохранить фильтр влажным в тех случаях, когда предполагается использовать его в других опытах по гибридизации.
2. В кассету для радиоавтографии помещают усиливающий экран, на него кладут рентгеновскую пленку, а сверху — фильтр, так чтобы его сторона с фиксированной ДНК была обращена к пленке. Если используются две рентгеновские пленки, то вторую пленку кладут поверх фильтра, затем помешают на нее второй усиливающий экран. Все операции проводят в темноте.
3. Кассету закрывают, заворачивают в алюминиевую фольгу и экспонируют при —70 С.
4. Проявляют пленку. Для выявления уникальных генов на Саузерн-блотах или небольших количеств мРНК в препаратах ро]у(А)-РНК на Нозерн-блотах обычно достаточно экспозиции в течение ночи. Если используются две рентгеновские пленки, то первую из них проявляют после экспозиции в течение ночи и, определив из радиоавтографа уровни сигнала и фона, находят время экспозиции второй пленки, отвечающее оптимальному отношению сигнал/шум.

радиоавтография

Изотоп P является источником жесткого излучения, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать осторожность и контролировать дозу облучения, получаемую персоналом. Период полураспада Р равен 14 сут, так что интенсивность его излучения каждые сутки снижается лишь на 5%. В результате Р-зонды приобретают то преимущество, что интенсивность сигнала можно повысить в 6 раз, увеличив время экспозиции от I во 7 сут (при условии, что фон остается на прежнем уровне).

Если ожидается, что сигнал будет очень слабым, то для дополнительного повышения чувствительности радиоавтографии можно использовать для одной рентгеновской пленки два усиливающих экрана. Для этого помещают рентгеновскую пленку между двумя усиливающими экранами и кладут ее в таком виде на фильтр, находящийся в кассете. При этом фильтр должен быть обращен к пленке той стороной, на которой фиксирована нуклеиновая кислота.

Чтобы обнаружить и локализовать последовательности-мишени, нужно выявить гибридизовавшиеся зонды. В опытах по гибридизации используются как изотопно, так и неизотопно меченные зонды. В первом случае их выявляют с помощью радиоавтографии; этот метод достаточно прост, но может потребовать длительной экспозиции. Выявление нерадиоактивных зондов — более сложный и трудоемкий процесс, основанный на использовании иммунохимических и аффинных методов.
Однако эти методы более безопасны и обычно позволяют быстрее получить результаты.

При блот-гибридизации обычно используются зонды, меченные изотопом 32Р. Образующиеся при его распаде высокоэнергетические р-частицы регистрируют с помощью рентгеновской пленки. Чувствительность детекции можно существенно повысить, используя усиливающий экран.

- Читать далее "Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов"

Оглавление темы "Гибридизация ДНК и РНК":
1. Мечение 3'-концов. 3-концевое мечение с использованием терминальной лезоксинуклеотидилтрансферазы
2. Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов
3. Гибридизация нуклеиновых кислот. Принципы гибридизации нуклеиновых кислот
4. Блот-гибридизация нуклеиновых кислот. Блот-гибридизация ДНК
5. Изготовление дот-блотов ДНК. Техника блот-гибридизации ДНК
6. Блот-гибридизация РНК. Изготовление Нозерн-блотов с РНК денатурированной глиоксалем/ДМСО
7. Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов
8. Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК
9. Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов
10. Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: