Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК

Материалы

Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 25 мМ трис-HCl, рН 8,5
• Предгибридизационный буфер: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% ДСН, 50% формамид. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить до 1%.
• Гибридизационная смесь: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% ДСН, 50% формамид, 10% дек-странсульфат, денатурированный меченый зонд. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить до 1% (о/о)
• Буфер для отмывания 1: 2 х SSC, 0,1% ДСН Буфер для отмывания 2: 0,25 х SSC, 0,1 % ДСН
• 20 х SSC
• 20 х SSPE
• 100 х раствор Денхардта

Методика
1. Промывают фильтры в стерильной дистиллированной обработанной ДЭПК воде. Фильтры с РНК, денатурированной глиоксалем, необходимо подвергнуть тепловой обработке, чтобы удалить из РНК остатки глиоксаля. Для этого прогревают фильтры при 80 °С в течение 10 мин в 25 мМ трис-HCl, рН 8,5, а затем медленно охлаждают до комнатной температуры. Если РНК денатурировали формальдегидом/формамидом, то фильтры перед гибридизацией можно не обрабатывать.
2. Помещают фильтр в пластиковый пакет, добавляют предгибридизационный буфер (из расчета 10 мл буфера на 100 см2 фильтра).

блот гибридизация рнк

3. Выдавливают из пакета все пузырьки воздуха, запаивают его и проводят предгибридизацию, выдержав пакет между двумя стеклами в течение 2—4 ч при 42 С.
4. Срезают один из углов пакета, сливают предгибридизационный буфер и заменяют его на гибридизационную смесь, содержащую денатурированный зонд (из расчета 4 мл смеси на 100 см2 фильтра). Для денатурации зонд можно просто выдержать в кипящей воде в течение 10 мин.
5. Выдавливают из пакета все пузырьки воздуха и снова его запаивают. Проводят гибридизацию, выдержав пакет между двумя стеклами в течение 16—40 ч при 42 С.
6. Осторожно, чтобы не повредить фильтр, вскрывают пакет и сливают гибридизационную смесь (ее можно использовать повторно). Если работают с изотопно меченными зондами, следует обеспечить их правильное хранение и захоронение радиоактивных отходов.

7. Один раз ополаскивают фильтр в буфере для отмывания 1 и выдерживают в трех сменах этого же буфера, по 5 мин в каждой смене, при комнатной температуре,
8. Промывают фильтр в трех сменах буфера для отмывания 2, по 5 мин в каждой смене, при комнатной температуре, затем в трех сменах того же буфера, по 30 мин в каждой смене, при 45-55 С.
9. Промокают фильтр и заворачивают его в пластиковую пленку. 10.Выявляют гибридизовавшийся зонд радиоавтографическими (изотопная метка) или гистохимическими (неизотопная метка) методами.

- Чтобы предотвратить утечку радиоактивно меченных зондов, пакет с гибридизационной смесью необходимо поместить во второй пакет и тоже запаять его,
- Жесткость условий, при которых проводят последние отмывания, можно повысить, уменьшив концентрацию SSC до 0,05 х (вместо 0,1 х). Чувствительность метода при этом обычно не снижается, поскольку при одних и тех же условиях Tm у ДНК—РНК- и РНК—РНК-гибридов выше, чем у гибридов ДНК—ДНК.

- Читать далее "Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов"

Оглавление темы "Гибридизация ДНК и РНК":
1. Мечение 3'-концов. 3-концевое мечение с использованием терминальной лезоксинуклеотидилтрансферазы
2. Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов
3. Гибридизация нуклеиновых кислот. Принципы гибридизации нуклеиновых кислот
4. Блот-гибридизация нуклеиновых кислот. Блот-гибридизация ДНК
5. Изготовление дот-блотов ДНК. Техника блот-гибридизации ДНК
6. Блот-гибридизация РНК. Изготовление Нозерн-блотов с РНК денатурированной глиоксалем/ДМСО
7. Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов
8. Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК
9. Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов
10. Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: