Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов

Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 6 М глиоксаль: хранят разлитым на аликвоты при -20 С
• Формальдегид: 37% водный раствор
• Формамид: хранят разлитым на аликвоты при —70 С
• 20 х SSC

Методика
1. Вырезают мембранный фильтр нужного размера, ополаскивают его в воде и вымачивают в 20 х SSC.
2. Денатурируют РНК с помощью глиоксаля или формальдегида/формамида.
а. Для денатурации с помощью глиоксаля добавляют следующие реактивы:
• 3 мкл раствора РНК (до 20 мкг)
• 2 мкл 6 М глиоксаля
• 5 мкл 20 х SSC

рнк дот блоты

Прогревают образцы в течение 1 ч при 50 °С б. Для денатурации РНК с помощью формальдсгида/форма-мида добавляют следующие реактивы:
• 2 мкл раствора РНК (до 20 мкг)
• 5 мкл формамида
• 2 мкл формальдегида
• 1 мкл 20 х SSC
Прогревают образцы в течение 15 мин при 65 °С.

3. Охлаждают денатурированную РНК во льду в течение 5 мин и собирают ее на дне пробирки кратковременным центрифугированием при 12 000 g.
4. Кладут мембранный фильтр на лист фильтровальной бумаги, припитанный 20 х SSC.
5. Наносят образцы денатурированной РНК на фильтр, разделив их на две равные порции1*.
6. Переносят фильтр на лист сухой фильтровальной бумаги, подсушивают его на воздухе и несколько раз ополаскивают в 20xSSC.

7. Фиксируют РНК на фильтре либо прожариванием при 80 °С в вакууме (нитроиеллюлозный фильтр), либо УФ-облучением в течение 3-5 мин (найлоновый фильтр). Подготовленный таким образом фильтр можно хранить при 4 °С; при этом нитроцеллюлозные фильтры необходимо хранить под вакуумом.
- Фильтры должны оставаться влажными (но не мокрыми) все время, пока наносится РНК. Для получения дот- и слот-блотов можно использовать также фирменные приборы для фильтрации. При нанесении РНК следует руководствоваться инструкцией фирмы-изготовителя.

Блот-гибридизацию РНК обычно проводят при 42 °С в присутствии 50% формамида. Чтобы повысить скорость процесса, иногда проводят гибридизацию при более высокой температуре, понизив при этом концентрацию формамида (для сохранения жесткости условий гибридизации), например, используют следующие условия: 48 С, 40% формамид. Однако следует иметь в виду, что при высоких температурах РНК деградирует и смывается с фильтра, так что необходимо поддерживать баланс между эффективностью гибридизации и стабильностью РНК. В протоколе описана процедура гибридизации для стандартных условий: 42 °С, 50% формамид.

- Читать далее "Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК"

Оглавление темы "Гибридизация ДНК и РНК":
1. Мечение 3'-концов. 3-концевое мечение с использованием терминальной лезоксинуклеотидилтрансферазы
2. Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов
3. Гибридизация нуклеиновых кислот. Принципы гибридизации нуклеиновых кислот
4. Блот-гибридизация нуклеиновых кислот. Блот-гибридизация ДНК
5. Изготовление дот-блотов ДНК. Техника блот-гибридизации ДНК
6. Блот-гибридизация РНК. Изготовление Нозерн-блотов с РНК денатурированной глиоксалем/ДМСО
7. Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов
8. Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК
9. Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов
10. Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: