При блот-гибридизации РНК происходит гибридизация иммобилизованной на фильтре РНК (суммарной РНК или мРНК) с мечеными ДНК- или РНК-зондами. Ниже мы рассмотрим способы получения РНК-блотов и их гибридизацию с ДНК-зондами.

Нативная РНК имеет четко выраженную вторичную структуру и поэтому плохо связывается с твердым матриксом (мембранными фильтрами). Для повышения эффективности связывания ее необходимо полностью денатурировать. Кроме того, наличие у РНК вторичной структуры приводит к изменению ее подвижности в геле и делает невозможным точное определение размера молекул. Для денатурации РНК используют глиоксаль/диметилсульфоксид (ДМСО) или формамид/формальдегид.

Эти методы одинаково эффективны, однако чаше применяют гели, содержащие формальдегид, поскольку их проще готовить и они более надежны. В протоколах соответственно описаны методы денатурации РНК при помощи глиоксаля/ДМСО и формальдегида/формамида.

Изготовление Нозерн-блотов с РНК, денатурированной глиоксалем/ДМСО

Материалы
Все реактивы должны быть свободны от РНКаз или обработаны ДЭПК.
• 10 х буфер для электрофореза: 100 мМ фосфат натрия, рН 7,0
• Смесь для денатурации: 3 мл 6 М глиоксаля, 7,5 мл ДМСО, 1,5 мл 10 х буфера для электрофореза. 12 мкл смеси для денатурации добавляют к 3 мкл раствора РНК (содержащего до 20 мкг РНК)
• Буфер для нанесения: 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий в 1 х буфере для электрофореза
• Агароза

Методика
1. Денатурируют РНК, выдерживая ее в течение 1 ч в смеси для денатурации при 50 °С.
2. Фракционируют РНК с помощью электрофореза в 1 х буфере для электрофореза. Обычно используют гель длиной 10—15 см, содержащий 1,1% (в/о) агарозу. Если размер молекул РНК < 1 т.н., то концентрацию агарозы нужно повысить до 1,3—1,5%. Подробнее об этом см. в протоколе 12.10.
3. Отрезают дорожки, на которые были нанесены маркеры мол. масс, и окрашивают их бромистым этидием (0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl, рН 9,0) в течение 30—60 мин,
4. На УФ-трансиллюминатор рядом с гелем (дорожка с маркером) кладут линейку и фотографируют их.

5. Глиоксилированную РНК переносят из агарозного геля на мембранный фильтр сразу после электрофореза без какой-либо дополнительной обработки геля (такая обработка уменьшила бы эффективность процесса). Для переноса используют такой же прибор, как в случае ДНК. Фильтр предварительно замачивают в 20 х SSC; этот же буфер применяют для переноса. Процесс обычно занимает 16 ч.
6. По окончании переноса гель вместе с фильтром помещают на лист сухой фильтровальной бумаги гелем вверх и мягким карандашом отмечают положение на фильтре геля и лунок.
7. Снимают гель и окрашивают его бромистым этидием (0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl) для проверки эффективности переноса.
8. Промывают фильтр несколько раз в 20 х SSC и подравнивают его края.

9. Нитроцеллюлозный фильтр прожаривают при 80 °С в вакууме в течение 2 ч, а найлоновый облучают УФ-светом в течение 3—5 мин на УФ-трансиллюминаторе. Обработанный таким образом фильтр можно хранить при 4 С; нитроцеллюлозные фильтры необходимо хранить под вакуумом.
11 Важно после переноса промыть фильтр в 20 х SSC для полного удаления всех следов агарозы. При необходимости РНК можно смыть с фильтра до ее постоянной фиксации буфером с низкой ионной силой.

- Читать далее "Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов"