Материалы
• Буфер ТЭ: 10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0
• 20xSSC
• Мембранные фильтры

Методика
1. Обрабатывают геномную ДНК ультразвуком при ~ 70 Вт в течение 1-2 мин. Размер получаемых фрагментов должен быть равен 5-10 т.п.н. (его проверяют при помощи электрофореза в агарозном геле).
2. Растворяют ДНК в ТЭ-буфере до нужной концентрации. Обычно используют суммарную геномную ДНК в концентрации 2,5 мкг на 5 мкл буфера.
3. Денатурируют ДНК в кипящей водяной бане в течение 10 мин, быстро переносят ее в лед на 5 мин и собирают ДНК на дне пробирки кратковременным центрифугированием при 12 000 g.
4. Во время денатурации готовят мембранный фильтр нужного размера, замачивают его в дистиллированной воде, затем переносят в 20 х SSC.

5. Кладут фильтр на лист фильтровальной бумаги, также вымоченной в 20 х SSC.
6. Наносят ДНК непосредственно на фильтр.
7. Переносят фильтр на лист сухой фильтровальной бумаги и ополаскивают в 5 х SSC в течение 5 мин.
8. Фиксируют ДНК на мембранном фильтре либо прожариванием при 80 °С в вакууме (нитроцеллюлозный фильтр), либо УФ-облучением в течение 3—5 мин (найлоновый фильтр). Подготовленный таким образом фильтр можно хранить при 4 С; нитроцеллюлозные фильтры необходимо хранить под вакуумом.

Фильтры должны оставаться влажными (но не мокрыми) в течение всего времени нанесения ДНК. ДНК должна быть растворена в буфере с низкой ионной силой (таком, как ТЭ) и не содержать ацетат-ионов. Для получения дот- и слот-блотов можно также использовать фирменные приборы. При нанесении ДНК следует руководствоваться инструкцией фирмы-изготовителя.

Блот-гибридизацию ДНК можно проводить при разных условиях, и их выбор определяется в основном личными предпочтениями исследователя. В целом при одинаковой жесткости условий гибридизации скорость реассоциации нуклеиновых кислот при высокой (65 °С) температуре выше, чем при низкой (42 °С) в присутствии формамида. В протоколе описана процедура высокотемпературной гибридизации.

Блот-гибридизация ДНК

Материалы
• Предгибридизационный буфер: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% (о/о)ДСН. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить • Гибридизационная смесь: 5 х SSPE, 5 х раствор Денхардта, денатурированная и обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося, 100 мкг/мл, 0,1% (о/о) ДСН, 10% декстрансульфат, денатурированный меченый зонд0. При работе с найлоновыми фильтрами концентрацию ДСН необходимо увеличить до 1% (о/о).
• Буфер для отмывания 1: 2 х SSC, 0,1 % ДСН
• Буфер для отмывания 2: 0,25 х SSC, 0,1 % ДСН
• 20 x SSC
• 20 х SSPE: 3 М NaCl, 0,3 М фосфат натрия, 40 мМ ЭДТА, рН 7,2
• 100 х раствор Денхардта: 2% (в/о) БСА, 2% (в/о) фиколл-400, 2% (в/о) поливинилпирролидон-360

Методика
1. Замачивают фильтр с иммобилизованной ДНК в воде и помешают его в пластиковый пакет.
2. Добавляют предгибридизационный буфер (из расчета 10 мл буфера на 100 см2 фильтра), удаляют из пакета все пузырьки воздуха и запаивают его. Помешают пакет между двумя стеклами и проводят предгибридизацию при 65 °С в течение 2-4 ч.
3. Срезают один из углов пакета, сливают буфер.
4. Добавляют в пакет с фильтром гибридизационный буфер, содержащий денатурированный зонд (из расчета 4 мл буфера на 100 см2 фильтра). Для денатурации зонд можно прогреть в кипящей воде в течение 10 мин.

5. Выдавливают из пакета все пузырьки воздуха и снова его запаивают. Помешают пакет между двумя стеклами и проводят гибридизацию при 65 °С в течение 16 ч.
6. Осторожно, чтобы не повредить фильтр, вскрывают пакет и сливают гибридизационную смесь. Эту смесь можно использовать повторно. Если зонд помечен радиоактивным изотопом, следует обеспечить его безопасное хранение и правильное захоронение радиоактивных отходов.
7. Несколько раз ополаскивают фильтр в буфере для отмывания 1 и выдерживают в трех сменах того же буфера при комнатной температуре, по 5 мин в каждой смене.
8. Промывают фильтр при комнатной температуре в трех сменах буфера для отмывания 2, по 5 мин в каждой смене.
9. Промывают фильтр при температуре 55—65 С в трех сменах буфера для отмывания 2, по 30 мин в каждой смене.

10. Аккуратно промокают фильтр и заворачивают его в пластиковую пленку.
11. При работе с изотопно меченными зондами проводят радиоавтографию в специальной кассете. Снизу в кассету помещают усиливающий экран, на него кладут рентгеновскую пленку и сверху помещают фильтр так, чтобы сторона с ДНК была обращена к пленке. Если используются нерадиоактивно меченные зонды, то фильтры обрабатывают блокирующими агентами, чтобы предотвратить фоновое окрашивание при обработке фильтра детектирующими реактивами. Фильтр можно хранить во влажном состоянии при 4 °С.
12. Изотопно меченные зонды должны иметь удельную радиоактивность ~ 10 имп./мин на 1 мкг. Обычно достаточно, чтобы радиоактивность гибридизационной смеси составляла 106—107 имп./мин на 1 мл. Кинетика реассоциации нерадиоактивно меченных зондов немного отличается от таковой для Р-зондов, и для достижения оптимальной чувствительности необходима более высокая концентрация зонда. Эту концентрацию можно рассчитать по следующей формуле:
А = В/50*1/С*16/Д, где А — необходимая концентрация зонда (мкг/мл)
В — «сложность» зонда
С — концентрация декстрансульфата (в %)
D — время гибридизации (ч) Концентрация зондов, полученных методом ник-трансляции, обычно составляет 50-100 нг/мл.

- Для предотвращения утечки изотопно меченных зондов гибридизационный пакет помещают во второй запаянный пакет.
- Жесткость условий, при которых проводятся последние отмывания, можно повысить, уменьшив концентрацию SSC (до 0,1 x вместо 0,25 х). Это обычно не сопровождается снижением чувствительности.

- Читать далее "Блот-гибридизация РНК. Изготовление Нозерн-блотов с РНК денатурированной глиоксалем/ДМСО"