Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов

Материалы
Те же, что и выше, со следующими изменениями:
Для биотина:
• 5 xTdT-буфер: 5 мМ CoCl2, 700 мМ какодилат натрия, 0,5 мМ ДТТ, 150 мМ трис-HCl, рН 6,8
• 11-dUТР:0,4ммоль
• Олигонуклеотид (до 1 мкг, что для олигонуклеотида из 20 звеньев соответствует примерно 150 пмолям 3-концов)
• ТdТ:50 ЕД/мкл

Методика
1. В помешенную в лед микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы:
• 5 х TdT-буфер 10 мкл
• Олигонуклеотид 10 мкл (150 пмолей)
• Bio-11-dUTP 1,75 мкл
• TdT 1 мкл (50 ЕД)
• Вода 27,25 мкл

мечение 3 концов

2. Перемешивают реактивы и быстро центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g. Инкубируют при 37 °С в течение 2 ч.
3. Доводят объем раствора с зондом до 100 мкл и очищают зонд центрифугированием на колонке, как это описано в протоколе 13.5. Меченый зонд содержит на 3-конце до трех остатков биотина. Хранят зонд при —20 °С.

Для дигоксигенина:
Материалы
Те же, что и выше, со следующими изменениями:
• 5 х TdT-буфер: 1 М какодилат калия, 125 мМ трис-HCl, рН 6,6, бычий сывороточный альбумин, 1,25 мг/мл
• СоС12:5мМ
• dATP: 2,5 мМ
• dig-H-dUTP:lMM
• Олигонуклеотид (до 1 мкг, что для олигонуклеотида из 20 звеньев соответствует примерно 150 пмолям 3-концов).
• TdT: 55 ЕД/мкл

Методика
1. В помещенную в лед микроцентрифужную пробирку вносят следующие реактивы:
• 5 x TdT-буфер 10 мкл
• СоС12 20 мкл
• dATP 3,5 мкл
• Олигонуклеотид 10 мкл (100 пмолей)
• dig-11-dUTP 1мкл
• TdT 1 мкл (50 ЕД)
• Вода 4,5 мкл

2. Перемешивают реактивы и быстро центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g. Инкубируют при 37 °С в течение 15 мин.

3. Доводят объем раствора с зондом до 100 мкл и очищают зонд центрифугированием на колонке, как это описано в протоколе. Олиго-зонд содержит «хвост» из меченых и немеченых нуклеотидов. Хранят зонд при -20 С.
Описанный в протоколе метод обычно используют для мечения коротких (длиной 20-30 звеньев) олигонуклеотидов. Клонированные в векторе М13 более длинные олигонуклеотиды (> 70 звеньев) метят с помощью удлинения «универсального» праймера. Альтернативный метод получения длинных зондов основан на отжиге двух разных олигонуклеотидов, содержащих на 3-концах комплементарные последовательности. Вторую цепь, комплементарную выступающим одноцепочечным участкам, достраивают с помощью фрагмента Кленова в присутствии меченых нуклеотидов. Метод удлинения праймера описан в предыдущих главах и работе.

Обычно олиго-зонды содержат только один меченый нуклеотид, поэтому их удельная радиоактивность значительно ниже (примерно 5 - 106 имп./мин на 1 мкг), чем у равномерно меченных зондов. Чтобы повысить чувствительность метода гибридизации, можно использовать «коктейль» из нескольких олигонуклеотидов, комплементарных разным участкам нуклеиновой кислоты-мишени.

Надежность и простота работы с плазмидами сделала их наиболее распространенным вектором для молекулярного клонирования. Интересующие исследователя фрагменты ДНК, переклонированные в плазмидах, необходимо ввести в бактериальную клетку-хозяина с помощью трансформации. Нами описан простой и эффективный метод введения сверхспиральной плазмидной ДНК в бактериальную клетку.

Мы также суммировали данные о радиоактивных и нерадиоактивных метках, которые можно использовать при работе с нуклеиновыми кислотами, и описали ряд ферментативных методов, пригодных для их включения.

В целом нерадиоактивно меченные зонды позволяют получить такую же чувствительность, что и зонды, меченные 32Р, при удельной радиоактивности последних 1—5 * 108 имп./мин на 1 мкг. Для получения меченых зондов в большинстве случаев можно использовать ник-трансляцию, ПЦР, метод рассеянной затравки, метод с использованием фаговых полимераз. Впрочем, иногда, например при гибридизации с мРНК, оптимальными являются РНК-зонды или «коктейль» из меченых олигонуклеотидов.

- Читать далее "Гибридизация нуклеиновых кислот. Принципы гибридизации нуклеиновых кислот"

Оглавление темы "Гибридизация ДНК и РНК":
1. Мечение 3'-концов. 3-концевое мечение с использованием терминальной лезоксинуклеотидилтрансферазы
2. Нерадиоактивное мечение 3'-концов. Техника нерадиоактивного мечения 3'-концов
3. Гибридизация нуклеиновых кислот. Принципы гибридизации нуклеиновых кислот
4. Блот-гибридизация нуклеиновых кислот. Блот-гибридизация ДНК
5. Изготовление дот-блотов ДНК. Техника блот-гибридизации ДНК
6. Блот-гибридизация РНК. Изготовление Нозерн-блотов с РНК денатурированной глиоксалем/ДМСО
7. Изготовление РНК-дот-блотов. Этапы изготовления РНК-дот-блотов
8. Техника блот-гибридизации РНК. Методика блот-гибридизации РНК
9. Выявление зондов с помощью радиоавтографии. Выявление гибридизовавшихся зондов
10. Выявление неизотопно меченных зондов. Выявление биотинилированных зондов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: