Последние несколько лет мы использовали для гибридизации in situ биотинилированные зонды, поскольку обнаружилось, что применение комплекса биотин—стрептавидин—кислая фосфатаза дает по крайней мере не худшие результаты, чем 3SS-зондов. Этот метод пригоден для исследования цитологических препаратов, замороженных срезов и препаратов, фиксированных формалином и заключенных в парафин. Обработку замороженных срезов в соответствии с протоколом начинают с протеолиза протеиназой К, но в более мягких условиях, при концентрации фермента 1—100 мкг/мл. Денатурацию проводят в течение всего 3-5 мин при 82 °С, а инкубацию с субстратом — в течение 10-30 мин, тоже гораздо меньше времени, чем обычно. Режим проявления красителя во время инкубации следует подбирать индивидуально, чтобы избежать неспецифического фонового окрашивания.

Предварительная обработка срезов:
1. Удаляют из срезов парафин.
2. Высушивают на воздухе, наносят на срезы раствор протеиназы К (0,5 мг/мл в ФСБ) и инкубируют в камере с высокой влажностью при 37 С в течение 10—15 мин.
3. Промывают срезы в трех сменах ФСБ, по 3 мин в каждой, и высушивают их на воздухе.

Гибридизация:
1. Растворяют 0,2 г декстрансульфата в 1 мл деионизованного формамида.
2. Готовят раствор для гибридизации, смешивая следующие компоненты:
• 20 х SSC 200 мкл
• ДНК спермы сельди, 2 мг/мл 400 мкл
Встряхивают смесь, добавляют раствор декстрансульфата в формамиде и еще раз перемешивают встряхиванием.

3. Приготовленной смеси достаточно для получения 2 мл раствора зонда; она составляет примерно 80% объема этого раствора.
4. Добавляют такое количество исходного раствора зонда, чтобы его конечная концентрация составила 2 мкг/мл, и доводят объем стерильной дистиллированной водой до 2 мл. Конечные концентрации должны быть следующими: 50% формамид, 2 х SSC, 10% декстрансульфат, 0,4 мг/мл ДНК спермы сельди.
5. Наносят 15—30 мкл раствора зонда на срез и сразу же накрывают его покровным стеклом подходящего размера.

6. Помещают препараты в пластиковый пакет, запаивают его и инкубируют при 110—120 С примерно 6 мин, пока температура на поверхности стекол, контролируемая специальным датчиком, не достигнет 93 °С. Переносят стекла в комнатную температуру.
7. С помощью шприца без иглы обмазывают по краям предметные стекла вместе с покровными резиновым клеем.
8. Помещают препараты в герметичную камеру и инкубируют при 37—50 "С, в зависимости от жесткости условий гибридизации, в течение ночи. На дно камеры наливают немного буфера для гибридизации, чтобы атмосфера была насыщена его парами и препараты не подсыхали.
9. Снимают покровные стекла, как это описано в протоколе.

Промывание препаратов:
1. Промывают препараты в двух сменах 2 х SSC, по 5 мин в каждой.
2. Промывают препараты в трех сменах 0,2 х SSC при 37—50 °С, по 5 мин в каждой.
3. Еще раз промывают препараты в 2 х SSC при комнатной температуре в течение 5 мин.

Детекция:
Материалы
• Буфер для промывания А: 1 М NaCl, 0,1 М трис-HCl, рН 7,5, 0,05% тритон Х-100
• Буфер для промывания В: 0,1 М NaCl, 0,1 М трис-HCl, рН 9,5

Методика:
1. С помощью пипетки наносят на препараты стрептавидин, конъюгированный с щелочной фосфатазой, и помещают их на 30 мин в камеру с высокой влажностью при 37 °С. Мы используем конъюгат фирмы Amersham, который разведен буфером А, содержащим 0,05% твин-20, в соотношении 1: 200.
2. Промывают препараты в трех сменах буфера А по 3 мин в каждой.
3. Промывают препараты в трех сменах буфера В, по 3 мин в каждой.
4. Инкубируют препараты 30-60 мин при 37 °С в растворе субстрата НСТ/БХИФ.
5. Останавливают инкубацию, промывая препараты в трех сменах воды, по 3 мин в каждой.
6. При необходимости контрастируют препараты подходящим красителем.
7. Дегидратируют препараты в батарее спиртов: 70%, 95%, абсолютный этанол, по 3 мин в каждом, затем проводят через две смены ксилола.
8. Покрывают препараты водорастворимой средой, например глицериновым желе.

- Читать далее "Оценка результатов гибридизации вирусов. Чувствительность гибридизации in situ"